利用羟基磷灰石纳米管修复大鼠颅骨骨缺损实验观察

朱彦丞, 郑　欣, 陈一心, 王晓波, 邱旭升, 施鸿飞, 王骏飞, 桂雪洋（南京医科大学鼓楼临床医学院, 南京　210008）

利用羟基磷灰石纳米管修复大鼠颅骨骨缺损实验观察

朱彦丞, 郑欣, 陈一心, 王晓波, 邱旭升, 施鸿飞, 王骏飞, 桂雪洋（南京医科大学鼓楼临床医学院, 南京210008）

目的观察羟基磷灰石纳米管（HANT）对大鼠颅骨缺损修复成骨的作用。方法采用自主合成的HANT（专利号： Zl201010123277.5），选用12只3月龄SD大鼠，在其双侧颅骨顶部对称部位各建立直径为5 mm的缺损。采用自身对照的方法, 在大鼠左侧颅骨缺损内植入0.5 g HANT粉末为实验侧, 右侧为空白对照侧, 单纯制作颅骨缺损, 不植入任何材料。在术后的12周进行CT的影像学观察分析，术后12周处死大鼠，取出颅骨，行组织病理学分析。结果术后大鼠均未发生感染死亡； 术后各期植入区CT扫描实验侧颅骨缺损处均可见HANT粉末，密度较骨组织低； 病理学分析显示对照侧可见骨缺损处有纤维细胞填充，未见骨缺损愈合； 实验侧颅骨缺损内侧壁有少量软骨细胞生长，骨缺损处可见未降解HANT粉末，大量纤维细胞长入包裹材料。结论HANT具有良好的生物相容性，但单纯应用HANT无法完全修复大鼠颅骨缺损，其成骨能力有待进一步实验改进及验证。

羟基磷灰石纳米管（HANT）； 大鼠； 颅骨缺损

随着交通事故的频繁发生, 各种开放性骨折日益增加, 由于损伤通常还伴有感染和骨缺损而导致了骨不愈合, 其治疗是骨科临床中的一大难题［1-3］。自体骨移植存在着来源的局限性、供骨区疼痛、感染等并发症以及不能制备成特定形状等不足。近年来随着骨组织工程学的迅速发展, 应用组织工程技术成骨作为自体骨移植替代材料将是骨缺损治疗的发展趋势。目前实验中常用的骨缺损修复材料有： 羟基磷灰石、胶原材料［4］、钙磷骨水泥和生物陶瓷等。

羟基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）是动物骨骼的主要无机成分，有良好的组织相容性、生物活性，植入人体后可在较短时间内与骨组织形成紧密连接，常被用作骨组织替代材料。肖智博等［5］将纳米级HA/聚酰胺复合材料、瑞邦骨泰、医用骨水泥植入兔胫骨骨缺损部位，结果显示，纳米级HA复合材料具有更好的生物相容性和骨传导性。生物体内的HA的形成是在富含羧基的蛋白质分子的调控下进行, 即生物矿化过程。作者利用生物矿化的原理, 用有机胺去矿化PO43-, 制备出单晶羟基磷灰石纳米管（HANT）。体外实验表明HANT具有良好的促细胞增殖及骨形成能力［6］。本研究中，作者建立大鼠的颅骨缺损模型，并以左右对照方式观察HANT成骨能力，为骨组织工程的研究提供参考。

1　材料与方法

1.1实验动物及主要仪器

3月龄SPF级雄性SD大鼠12只，体质量150～250 g, 由南京大学医学院附属鼓楼医院动物中心［SCXK（苏）2006-0009］。饲养条件： 温度20～25℃，相对湿度40%～70%，12 h昼夜间断照明［［SYKX（苏）2014-0052］。 切片机（RM2235，德国），高速涡轮牙科钻（上海齿科机械厂），CT（Lightspeed 16层螺旋CT，美国GE公司）。

1.2实验方法

1.2.1HANT的制备采取Guo等［6］方法，应用生物矿化原理，将有机胺溶液缓慢加入Ca（H2PO4）2和CaCl2混合溶液中，6 h采用水热法并调节pH值为8.2, 使有机胺-NH2, 去矿化PO43-, 制备出单晶HANT，在透射电镜下进行扫描可观察到其具有横切面为正六边形面的单晶结构。纳米管的内直径大小8～50 nm, 外直径20～80 nm, 长1～20 μm。

1.2.2动物模型建立选用12只3月龄SD大鼠，采用体积分数3%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉。麻醉起效后，取俯卧位，颅顶区备皮、消毒铺巾，沿颅顶纵向切口切开皮肤并充分暴露双侧顶骨。用高速涡轮牙科钻在双侧顶骨的外下象限处造成直径为5 mm圆形全层骨缺损，缺损间隔约为3 mm（图1）。钻取过程中，助手持续生理盐水滴注降温，取颅骨片时避免损伤下方硬脑膜。实验采用自身对照的方法，在大鼠左侧颅骨缺损内植入0.5 g HANT粉末为实验侧； 右侧为空白对照侧，单纯制作颅骨缺损，不植入任何材料。探查手术区域无活动性出血后，逐层缝合手术切口。术后腹腔内注射青霉素4万单位，连续3 d。

1.3检测指标

1.3.1大体观察记录各组大鼠伤口愈合、进食活动等一般情况，以及颅骨缺损区域质地与血供等。1.3.2CT及三维重建观察术后12周行CT扫描三维重建观察各组大鼠颅骨缺损的生长愈合情况，并通过影像归档和通信系统（PACS）软件对三维重建的图像进行颅骨缺损面积的测量。

1.3.3组织学观察术后12周处死大鼠, 取出大鼠顶骨缺损区域，PBS缓冲液冲洗后用甲醛溶液固定，48 h后在10%EDTA溶液中脱钙，每3 d更换一次脱钙液，酒精逐级脱水，随后石蜡包埋切片，采用HE染色并观察HA纳米材料与宿主的反应和新生骨形成情况，是否有炎症反应，细胞类型，材料降解情况等。

1.4统计学方法

2　结果

2.1大体观察

实验过程无大鼠死亡，术后切口愈合良好，进食和日常活动正常。实验侧植入部位稍有肿胀，按压有硬结感，术后12周，取标本可见为组织增生，边缘不规则，切开可见组织包裹的HANT粉末。对照侧术后早期稍有肿胀，随即消肿，按压有凹陷感。

2.2CT三维重建图像观察

术后12周植入区CT扫描, 可见颅骨缺损部位均未修复, 对照侧颅骨缺损部位为均匀透射区, 实验侧颅骨缺损处密度较对照侧稍高，但低于骨组织，考虑为HANT粉末（图2）。CT三维重建测量颅骨缺损面积, 实验侧（18.07±1.52 mm2）与对照侧（17.39 ±1.33 mm2）没有统计学差异（P=0.26）。

2.3组织学观察

对照侧可见骨缺损处有纤维细胞填充，未见骨缺损愈合（图3A）； 实验侧骨缺损处可见未降解的HANT粉末，颅骨缺损内侧壁有少量软骨细胞生长，大量纤维细胞长入包裹材料，颅骨缺损未修复（图3B）。

3　讨论

HA作为动物骨骼的主要无机物，有着和自然骨相类似的结构，其良好的组织相容性，可引导骨的生长，因而常被用为骨的替代产品。耿海霞等［7］将HA/凝胶复合物植入兔颅骨缺损模型中, 12周后CT检测示，材料与缺损边缘部分紧密融合，可见该HA复合物在兔颅骨缺损中有着较好的修复效果。但HA材料也存在着力学性能差、强度低、难以吸收的缺点。纳米技术借助与纳米粒子的表面效应、小分子效应及量子效应等，从纳米结构上重构材料的晶体微径，可有效提高材料的生物性能，已有研究证实其拥有更好的生物相容性和生物活性，并且局部无炎症和异物反应，无致畸和致癌作用［8］。王大平等［9］研制出纳米级HA人工骨，并用于治疗27例骨缺损患者，平均随访18.5个月，影像学显示纳米HA人工骨材料与宿主骨相容性好，可直接愈合，未见不良反应，认为其是一种理想的骨缺损修复材料。另有研究显示HA粒径越小，植入材料的扭转模量、拉伸模量以及强度越高，抗疲劳性能也越强，因此纳米级HA材料相比于普通HA可能具有更佳的力学性能［10］。

图1　造模实验术中照片

图2　术后12周大鼠颅骨CT及三维重建结果

A： 对照侧可见骨缺损处有纤维细胞填充包裹, 未见骨缺损愈合（箭头所示）（HE ×40）；　B： 实验侧骨缺损处可见未降解HANT粉末，颅骨缺损内侧壁有少量软骨细胞生长，大量纤维细胞长入包裹材料（箭头所示）（HE×10）

本实验采用的HANT材料, 晶粒尺寸在纳米量级, 直径为20～80 nm、长1～20 μm，肉眼观为粉末状。微观上有着更大的表面积，理论上可增强骨诱导及骨传导能力。在前期的体外实验中作者将25 μg/mL HA纳米材料和骨髓间充质干细胞共培养,发现细胞的增殖速度增高了1.5倍, 对比骨形成蛋白7 （BMP7）拥有更强的促成骨细胞增殖能力［11］。

颅骨由于其缺少肌肉组织，血供及骨自身再生力差，并且大部分哺乳动物颅骨是膜性化骨，胚胎源类似，因而大鼠的颅骨缺损模型常被用于分析骨缺损部位骨移植材料修复的效果。本实验采用Bosch等［12］提出的双侧直径5 mm标准骨缺损模型（critical size defect，CSD）的方法制备大鼠颅骨缺损模型。Schofer等［13］动物实验表明，直径5 mm大鼠颅骨缺损模型在术后12周后仅有纤维组织生成，骨缺损边缘仅可见少量新骨形成，提示直径5 mm可作为大鼠颅骨CSD模型的理想尺寸。本实验在大鼠颅骨双侧造成直径5 mm全层缺损，术后12周在空白对照侧行影像学及组织学检查，表明缺损不能自行修复，证实了Bosch等［12］的结论。

本实验中，为评估HANT的自身骨修复能力，仅单纯将HANT粉末置于大鼠颅骨缺损处。Bodde等［14］研究表明术后8周到12周是骨缺损在完成修复过程中的一个重要过渡阶段。为了完成动物自身骨缺损的修复过程，本文作者选择术后12周作为骨修复的观察时间。术后12周，大鼠的实验侧与对照侧CT三维重建的颅骨缺损面积比较，两者无统计学差异，且均未修复。标本组织病理学检测结果提示，HANT粉末已部分降解，材料被长入的纤维细胞包裹，但颅骨缺损未修复。考虑在本次实验中植入的是单纯HANT粉末，在动物体内的分散性较差，导致了材料聚集现象而使HANT粉末簇拥成团，致使成骨诱导和骨传导能力大大降低。

本实验表明HANT具有较好的生物相容性，但单纯应用HANT无法完全修复大鼠颅骨缺损，后续研究可在HANT中加入BMP或人骨间充质干细胞，对其成骨能力进行进一步验证。

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Experimental Observationon Repair of Calvarial Defects by Hydroxyapatite Nanotube

ZHU Yan-cheng, ZHENG Xin, CHEN Yi-xin, WANG Xiao-bo, QIU Xu-sheng, SHI Hong-fei, WANG Jun-fei, GUI Xue-yang
（Department of Orthopedics， The Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing Medical University， Nanjing210008， China）

ObjectiveTo investigate the ostegenesis by hydroxyapatite nanotube（HANT） in a calvarial defect model. MethodsBilateral full-thickness defects （5 mm in diameter） of parietal bone were created in twelve three -month-old SD rats. The left defected side was filled with 0.5 g HANT （patent number： Zl201010123277.5） as experimental side and the right side was set as control. CT were taken at 12 weeks postoperation. The rats were euthanized at 12 weeks after surgery and the specimens were harvested for patholologic analysis. ResultsThere was no infection or death on the surgical models. CT examination demonstrated that the residual HANT powder could be seen on the experimental side of the skull defect, but the density is lower than bone. Pathologic analysis showed that bone defect in the control side was filled with fiber cells. The powder partly degraded in the experimental side, few chondrocytes were found, and a large number of fiber cells enwrapped the powder. ConclusionThe HANT has good biocompatibility, but singly implanting the nanotube can't completely repair the skull defect of rats. Therefore, its osteogenic ability need to be refined in further experiment.

Hydroxyapatite nanotube； Rats； Calvarial defect

Q95-33

A

1674-5817（2015）05-0390-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.05.009

2015-05-05

国家自然科学基金项目（81401793）； 江苏省社会发展基金项目（BE2011604）； 江苏省六大人才高峰项目（2012-WS-092）； 南京市卫生局项目（YKK13079、ZKX12016）

朱彦丞（1990-）, 男, 骨外科学硕士, 研究方向： 骨创伤。E-mail： tonyzuyanjiu@163.com

陈一心。E-mail： chenyixin93@126.com