dl -扁桃酸阴道热敏凝胶剂对小型猪阴道黏膜刺激性的研究

夏敏杰, 黄　超, 田　芳, 王玉柱, 职瑞娜,2, 丁训城, 严钱勤, 李卫华

（1. 上海市计划生育科学研究所, 国家计划生育药具重点实验室, 上海　200032；

2. 复旦大学公共卫生学院, 上海　200032；　3. 上海市第六人民医院, 上海　200233）

dl -扁桃酸阴道热敏凝胶剂对小型猪阴道黏膜刺激性的研究

夏敏杰1, 黄超1, 田芳1, 王玉柱1, 职瑞娜1,2, 丁训城1, 严钱勤3, 李卫华1

（1. 上海市计划生育科学研究所, 国家计划生育药具重点实验室, 上海200032；

2. 复旦大学公共卫生学院, 上海200032；3. 上海市第六人民医院, 上海200233）

目的研究dl-扁桃酸阴道热敏凝胶剂对小型猪阴道黏膜的刺激性。方法将9只雌性小型猪按体质量随机分为空白胶组、dl-扁桃酸阴道热敏凝胶剂组和市售壬苯醇醚凝胶（N-9凝胶）组, 肌肉注射苯甲酸雌二醇400 μg/kg（促发情）, 12 d后建立小型猪阴道刺激性试验模型，阴道给予5 mL凝胶, 每日一次, 连续给药7 d, 在给药前和末次给药后的24 h与72 h，收集阴道灌流（CVL）液, 流式细胞仪计数炎性细胞和中性粒细胞数目； 末次给药72 h后处死小型猪, 取阴道组织, 观察阴道黏膜组织病理学改变。结果dl-扁桃酸阴道热敏凝胶剂组CVL液中炎性细胞、中性粒细胞数目明显低于N-9 凝胶组（P＜0.05）。小型猪阴道黏膜组织HE染色显示, dl-扁桃酸阴道热敏凝胶剂处理组阴道黏膜无明显上皮破损、血管充血以及炎症细胞浸润, 其刺激性评分（5.10±0.47）, 与空白胶组（3.30±1.60）比较无显著性差异（P＞0.05），明显低于N-9 凝胶组（20.50±3.50）（P＜0.05）。结论dl-扁桃酸阴道热敏凝胶剂对小型猪阴道黏膜刺激性较小。

dl-扁桃酸阴道热敏凝胶剂； 小型猪； 炎性细胞； 中性粒细胞

长期以来，国内外通常选用家兔阴道刺激性模型（rabbit vaginal irritation，RVI）来评价外用避孕药的阴道黏膜刺激性，并以此作为临床前安全性评价的标准模型［1］。但RVI模型具有明显局限性，首先，家兔阴道解剖学结构与人差异明显，其次，RVI模型对大部分人源生殖道病原体不敏感，并且它并不能准确反映出黏膜上皮炎症因子的变化和免疫细胞的活化情况［2］。

小型猪与人类阴道无论是在组织学、亚细胞结构甚至渗透性方面都有着较多相似之处，因此可将小型猪作为一种新的评估阴道黏膜刺激的合适模型［3］。此外，小型猪模型可以提供对阴道灌流液中免疫细胞活化状态和细胞因子释放进行动态细致的检测与分析，使其成为一个良好的人类阴道组织替代品［3］。

本课题组前期探索研究表明，dl-扁桃酸可能具有较强的体外抑制精子的活性，它通过影响精子顶体和降低线粒体膜电位，引发精子运动障碍，从而对精子起到制动作用。dl-扁桃酸阴道热敏凝胶剂（dl-Mandelic acid thermosensitive in situ gel，dl-Mandelic acid-TISG, 以下简称dl-扁桃酸凝胶）是以dl-扁桃酸为主药的一种新型热敏型酸性水溶性凝胶（pH 3.5～3.9）, 一方面依靠dl-扁桃酸自身良好的抑精作用，另一方面依靠凝胶系统自身具有的酸缓冲作用，维持阴道正常酸性微环境和微生态平衡，从而达到制动精子和抑制病原微生物的杀精避孕目的。本文将以小型猪为动物模型, 市售N-9 凝胶为阳性对照, 评价dl-扁桃酸凝胶的阴道刺激性作用。

1　材料与方法

1.1试剂与仪器

dl-扁桃酸（mandelic acid, 纯度≥95%, 购自上海贝合化工有限公司）； 泊洛沙姆407（Poloxamer 407, P4 0 7, 德国BAS F公司）； 羟丙甲基纤维素（HPMCK4M, 美国DOVV公司）； 苯甲酸雌二醇注射液（上海通用药业股份有限公司）； 市售壬苯醇醚胶剂（N-9 凝胶）商品名“乐乐迷”，凝胶中含N-9 40 mg/mL（中国药科大学制药有限公司）。荧光分选细胞仪（FACS Calibur型，美国Becton Dicknson公司），病理显微镜（C31，日本Olympus公司）。

1.2dl -扁桃酸凝胶的制备

称取一定量的dl-扁桃酸和热敏凝胶基质泊洛沙姆407, 加入0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH=3.5）, 于磁力搅拌器下使其分散均匀，然后置4 ℃冰箱中冷藏12 h, 使dl-扁桃酸凝胶充分溶解、均匀分散至无色透明状态, 最后配置成dl-扁桃酸浓度为5 mg/mL的热敏凝胶剂，其pH为3.5～3.9, 且能随外界温度由液状（温度≤ 28 ℃）转变为凝胶状（温度≥ 32 ℃）。

1.3实验动物及饲养条件

成年雌性广西巴马小型猪9只, 体质量35～40 kg,购自上海浦东新区华新特种养殖场［SCXK（沪）2012-0013］。饲养于上海市第六人民医院普通级动物房［SYXK（沪）2011-0128］, 温度为（25±3） ℃, 12 h/12 h明暗周期，动物食用标准颗粒饲料，自由饮水。

1.4阴道黏膜刺激性试验（pig vaginal irritation，PVI）［4］

9只雌性小型猪, 适应环境2周后，按体质量随机分成3组： ①空白胶组（无药热敏凝胶 5 mL/d）；②N-9 凝胶组（N-9 凝胶25 mg/d）； ③dl-扁桃酸凝胶组（dl-扁桃酸凝胶25 mg/d）。每组3只，给药前小型猪肌肉注射苯甲酸雌二醇400 μg/kg促发情，同步各组小型猪发情周期。苯甲酸雌二醇注射后的12 d开始阴道给药, 每次给药5 mL, 连续给药7 d。

1.5阴道灌流液收集

在首次给药前, 以及末次给药后24 h和72 h分别采集阴道灌流（CVL）液。用20 mL无菌PBS（pH 7.2）对各处理组小型猪进行阴道灌洗，收集CVL液。

1.6流式细胞仪检测CVL液中的炎性细胞［5］

CVL液经200目的细胞筛过滤去除杂质后，置离心管中，常温1 000×g，5 min离心收集细胞，用含1%庆大霉素的PBS重悬， 体积分数1%多聚甲醛1∶1固定，荧光分选细胞仪检测，应用CellQuest多功能分析软件收集，并计数10 000个细胞。根据向前散射光（FSC）为横坐标，侧向散射光（SSC）为纵坐标，设门分选出淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和阴道上皮细胞四个独立细胞群的二维散点图。用FlowJo软件分别标出每个细胞群占检测细胞总数的百分比。

1.7小型猪阴道取材及病理检查和评分

末次给药72 h后处死小型猪，解剖摘取完整阴道组织，纵向切开，肉眼观察是否充血、水肿等异常表现，然后用体积分数10%中性缓冲甲醛固定制成石蜡切片，HE染色，组织病理学检查。按照D'Cruz提出阴道刺激性试验方法和标准［6］，选择若干更易判断的病理终点（包括： 溃疡/坏死、白细胞浸润、充血、出血、水肿、空泡化等）反映阴道黏膜上皮、固有层及其血管和周围组织的病理变化，采用5个等级表示刺激的严重程度，评分标准：无变化=0；轻微=1；温和=2；中等=3；严重=4，从而记录药物对小型猪阴道黏膜的刺激性。各项病变以0～4分记录，总分为32分。

1.8统计学分析

2　结果

2.1CVL炎性细胞分析

FACS caliber型流式细胞仪检测3次CVL液包括中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和阴道上皮细胞的变化。由图1可知, 给药前各组小型猪CVL液炎性细胞极少（图1A、D、G）, 组间差异不明显。在末次给药后24 h和72 h, 空白胶组炎性细胞和中性粒细胞无明显变化（图1B、C）, 而dl-扁桃酸凝胶组和N-9 凝胶组中性粒细胞均有升高，但dl-扁桃酸凝胶组的增幅显著低于N-9 凝胶组，末次给药后24 h, dl-扁桃酸凝胶组约为18%, N-9 凝胶超过40%（图1E、H）, 末次给药后72 h, dl-扁桃酸凝胶组约为19%, 无明显上升, 而N-9 凝胶接近50%, 有显著上升（图1F、I）。结果表明连续给药7 d后已有中性粒细胞由阴道进入CVL液中, 但N-9 凝胶组中的中性粒细胞显著高于dl-扁桃酸凝胶组。不同时间各处理组小型猪CVL液的炎性细胞数, dl-扁桃酸凝胶组与空白胶组相比, 有增加趋势, 但仍显著低于N-9 凝胶组。上述结果说明, dl-扁桃酸凝胶虽能引起小型猪CVL液的炎性细胞、特别是中性粒细胞的轻微的升高，但仍明显低于市售的N-9凝胶。

2.2猪阴道组织病理学分析

表 1　各组小型猪不同时间CVL的中性粒细胞百分率　%

根据向前散射光（FSC）为横坐标，侧向散射光（SSC）为纵坐标，设门分选出淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和阴道上皮细胞四个独立细胞群的二维散点图。这是来自处理组其中之一的典型图谱，每个样本分析10 000个细胞，用FlowJo软件分别标出每个细胞群占检测细胞总数的百分比（%）。A： 空白胶给药前； B： 空白胶末次给药后24 h； C： 空白胶末次给药后72 h； D： dl-扁桃酸凝胶给药前； E： dl-扁桃酸凝胶末次给药后24 h； F： dl-扁桃酸凝胶末次给药后72 h； G： N-9 凝胶给药前； H： N-9 凝胶末次给药后24 h； I： N-9 凝胶末次给药后72 h

表 2　各组小型猪不同时间CVL的炎性细胞百分率　%

空白胶组黏膜上皮结构完整，固有层无明显空泡和水肿，损伤不明显（图2A、B、C）。dl-扁桃酸凝胶组黏膜上皮基本结构完整，黏膜固有层毛细血管充血明显，但炎症细胞无明显增多（图2D、E、F）。4%N-9凝胶组黏膜上皮结构损伤明显，出现空泡、水肿，并出现局部脱落，伴炎症浸润，黏膜固有层充血明显，血管周围炎症细胞明显增多，局部炎症细胞浸润明显（图2G、H、I）。而在表3小型猪阴道刺激评分中，空白胶组各项评分处于最低，其总分也最低, 为3.3±1.6, 而N-9 凝胶组各项评分最高，总分20.5±3.5，dl-扁桃酸凝胶组总分5.1±0.5，稍高于空白胶组，但低于N-9 凝胶组，说明在给药后，空白胶组阴道受刺激最轻，对阴道黏膜基本无损伤，而N-9 凝胶组刺激最为严重，对阴道黏膜损伤较为严重，dl-扁桃酸凝胶虽对阴道黏膜有一定的刺激，但其刺激作用显著低于N-9 凝胶。

3　讨论

近年来外用避孕药物研发迅速，其中主要一类药物为以N-9为代表的表面活性剂，虽具有较强的杀精子作用，但是作为一种表面活性剂，在杀精子的同时，也对阴道黏膜细胞有较强的刺激作用，长期使用将会破坏阴道黏膜上皮屏障的完整性，而且能诱发黏膜的炎症反应，影响阴道黏膜的免疫功能［7-9］。为了寻找安全有效、对阴道黏膜刺激性小、能维护阴道正常微生态的外用避孕新药，dl-扁桃酸的前期研究已证明其具有很好的抑精作用，但其作为外用避孕药的安全性尚不明确。

图2　小型猪阴道组织病理学分析（HE×200）

表 3　小型猪阴道黏膜刺激性评分

生殖道炎症和免疫防御功能在性传播疾病的发生发展过程中扮演者关键角色。炎性细胞中的中性粒细胞数量及其活化状态是验证阴道黏膜炎症反应的重要参考指标，炎性细胞数的升高往往与阴道黏膜损伤、免疫炎症反应以及性传播疾病的感染相关［10］。研究表明N-9能引起阴道黏膜上皮的损伤和严重的组织炎症反应，引起大量炎症细胞特别是中性粒细胞等进入阴道灌流液中［11］。本研究采用流式细胞技术分析小型猪阴道灌流液中的炎性细胞数量及其活化状态，发现相dl-扁桃酸凝胶组中阴道灌流液中的炎中性粒细胞的轻微的升高，但仍显著低于市售的N-9凝胶。由此证明，dl-扁桃酸虽然在一定程度上能引起阴道黏膜的炎症反应，但其严重程度显著低于N-9 凝胶。

通过阴道灌流液的监测，可以了解阴道黏膜的炎症反应，而通过组织病理技术可以直观分析药物对阴道黏膜刺激损伤作用［12］。本课题组按照D'Cruz等提出的阴道刺激性实验方法来评估阴道黏膜受损状况。在末次给药72h后处死动物，收集阴道组织制成石蜡切片，HE染色，进行常规病理分析。在阴道黏膜上皮，黏膜固有层，血管与血管周围，N-9凝胶组均出现较为严重的损伤，表现为黏膜溃疡、细胞坏死，白细胞浸润、出血、水肿等，而dl-扁桃酸凝胶组与空白胶组多数指标无显著差异，但血管周围组织充血较明显，其程度与N-9凝胶相似。

在本研究中为了探明dl-扁桃酸作为外用避孕药的安全性，作者采用了雌性广西巴马小型猪作为阴道黏膜刺激模型。dl-扁桃酸凝胶和市售N-9凝胶比较结果表明，前者对阴道黏膜的刺激作用显著低于后者，扁桃酸具有更高的安全性。而小型猪作为阴道黏膜刺激模型，能够客观的反应阴道损伤情况，以及免疫细胞与细胞因子的活化状态，因此是一种很好的动物模型。此外，dl-扁桃酸作为外用避孕新药，其长期应用的有效性和安全性，有待更进一步的实验研究。

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［Abctract］ObjectiveTo study the vaginal irritation of dl-Mandelic acid thermosensitive in situ Gel （dl-Mandelic acid-TISG） in miniature pigs. MethodsNine miniature pigs injected with estradiol benzoate （400 μg/kg） were randomly divided into three groups： control group, dl-Mandelic acid -TISG group and nonoxynol-9 gel （N-9 gel） group. Each miniature pig was administrated with 5 mL gel through vagina once daily for 7 days. Cervicovaginal lavage （CVL） fluids were collectedbefore administration and at the 24 h and 72 h after the last administration. The number of inflammatory cells and neutrophilic granulocytes in the CVL were detected by the flow cytometry. The miniature pigs were sacrificed at 72 h after the last administration. Histopathological changes of the vaginal mucosa were observed under light microscope. ResultsThe number of inflammatory cells and neutrophilic granulocytes in the dl-Mandelic acid-TISG group were significantly lower than that in the N-9 group （P＜0.05）. Histological scoring of vaginal mucosa showed that there were no obvious mucosal epithelium damage, vascular congestion and inflammatory cell infiltration （5.10±0.47） in the dl-Mandelic acid-TISG group.There was no significant difference （3.30±1.60, P＞0.05） compared with the control group （P＞0.05） but significant difference compared with the N-9 group （20.50±3.50, P＜0.05）. ConclusionThe vaginal irritation of dl-Mandelic acid-TISG in miniature pigs is mild.

Study on Vaginal Irritation of dl-Mandelic Acid Thermosensitive in situ Gel in Miniature Pig

XIA Min- jie1, HUANG Chao1, TIAN Fang1, WANG Yu- zhu1, ZHI Rui- na1,2, DING Xun-cheng1, Yan Qian-Qin3, LI Wei- hua1
（1. State Key Labs of Family Planning Devices， Shanghai Institute of Planned Parenthood Research，Shanghai， 200032， China； 2. School of public health， Fudan University， Shanghai 200032， China；3.The Sixth People's Hospital， Shanghai 200233， China）

dl-Mandelic acid-TISG； Miniature pig； Inflammatory cells； Neutrophilic granulocytes

Q95-33

A

1674-5817（2015）05-0356-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.05.003

2015-01-27

国家科技重大专项（2012ZX10001007-009-003, 2013ZX10001006-003-002）； 十二五国家科技支撑计划（2012BAI31B04）； 国家自然科学基金青年基金项目 （81100459）； 上海市科委项目（13431900800）；上海市人口和计划生育委员会（2012JG03）。

夏敏杰（1983-）, 男, 硕士, 研究实习员, 遗传学。E-mail： mito1983@163.com。

李卫华, 女, 博士, 研究员。E-mail： iamliwehua@yahoo.com。严钱勤, 女, 本科, 主管技师。E-mail： yanqianqin3@sina.com