两种大鼠骺板损伤模型的比较

景金珠, 李清海, 吕学敏, 梁　震, 王　猛

（1. 北京积水潭医院 北京市创伤骨科研究所, 北京　100035；

2. 山东泰安军分区第一干休所, 泰安　271000；

3. 北京积水潭医院小儿骨科, 北京　100035）

两种大鼠骺板损伤模型的比较

景金珠1, 李清海2, 吕学敏3, 梁震1, 王猛1

（1. 北京积水潭医院 北京市创伤骨科研究所, 北京100035；

2. 山东泰安军分区第一干休所, 泰安271000；

3. 北京积水潭医院小儿骨科, 北京100035）

目的比较直接刮除法和手动成角法制备的骺板损伤模型的差别，为更好地研究骺板损伤的病变进程、治疗和预后提供实验基础。方法4～5周龄Wistar大鼠45只，分为3组, 第1组为对照组，不作处理，正常饲养； 第2组为直接刮除组，直接切除胫骨上端前内侧骺板制作骺板损伤模型； 第3组为手动成角组，采用外翻用力，并适当加用剪切力使骨骺在骺板软骨水平与干骺端分离制作骺板损伤模型。均于术后4 d、10 d和21 d处死，取双侧胫骨。行Micro-CT扫描，用系统分析软件CTAn（comprehensive TeX archive network）测量各时间点双侧胫骨长度、胫骨粗隆宽度以及胫腓骨之间最宽距离的差值，并进行统计学分析。组织学切片HE染色，观察损伤骺板在各时间点的形态学特征。结果直接刮除法与手动成角法Micro-CT、HE染色检测显示，二者在术后4 d均见到骺板宽度增加，前者出现周围骨质密度减低和幼稚软骨细胞； 术后10 d，前者出现骺板变窄，后者开始出现周围骨质密度减低；术后21 d，前者有明确的骨桥形成，骺早闭出现，后者仅见细小新生骨质。标本大体测量结果显示，术后各时间点两种方法胫骨长度差值、胫骨粗隆宽度差值以及胫腓骨之间最宽距离的差值均显著高于对照组（P＜0.05）； 术后21 d，直接刮除组数据均大于手动成角组（P＜0.05）； 术后4 d和10 d，两种方法没有显著性差异（P＞0.05）。结论直接刮除法制作的大鼠骺板损伤模型，具有相对明确的均一性和稳定的造模成功率，更适合于对骺板损伤的机制探讨等基础性研究。

动物模型； Micro-CT； 骺板损伤

儿童的骺软骨和骺板软骨远比骨骺和韧带脆弱, 因此骺板损伤在儿童骨关节创伤中最为常见, 据统计, 儿童时期的长管状骨骨折, 约15%～18%累及骺板, 而因骺板损伤导致明显畸形者约占10%［1］。骺板损伤导致骨骺与干骺端之间形成骨桥，使骺板全部或部分提前闭合，造成肢体短缩和（或）成角畸形［2］，影响儿童生长发育，而且其治疗非常困难，目前尚无特异的治疗手段。因此，骺板损伤一直是小儿骨科界研究的热点问题，近年来不少学者致力于小儿骺板损伤的诊断和治疗，在组织学、影像学、生物力学、分子生物学等方面取得了一定进展［3,4］，各种动物实验和临床治疗方法的报道也较为常见。骺板损伤按Salter-harris 分型法，分为五型［5］，其中Ⅱ型（剪式和推压的合力，使骺板裂开，同时引起干骺端骨折）最为多见。作者采用直接刮除法和手动成角法构建大鼠胫骨近端II型骺板损伤模型，并于术后不同时间点取材，进行组织学观察、Micro-CT扫描并测量大体数据，动态观察和比较两种方法制备骺板损伤模型的差异，为更好的研究骺板损伤的病变进程以及治疗和预后提供实验基础。

1　材料与方法

1.1实验动物

清洁级4～5周龄Wistar大鼠46只（1只麻醉意外死亡），雌雄不限，体质量150±10 g，购于维通利华实验动物中心［SCXK（京）2011-011］。

动物实验场地： 北京积水潭医院屏障动物室［SYXK（京）2012-0027］。

1.2仪器、试剂

Micro-CT（Skyscan1172, 产地比利时）, RM-2235组织切片机购自德国Leica公司。甲醛、苏木素、伊红等组织切片和染色用试剂购自北京赛驰生物科技有限公司，国产分析纯乙醚。

1.3方法

1.3.1大鼠骺板损伤模型建立将大鼠分为3组, 第1组为对照组，不作处理，正常饲养； 第2组为直接刮除组，直接切除法制作骺板损伤模型； 第3组为手动成角组，采用手动损伤的方法制作骺板损伤模型。直接刮除组： 大鼠行乙醚麻醉，仰卧固定于手术台上，右侧膝关节胫骨上端前内侧逐层纵向切开，用无菌纱布清理伤口，切除胫骨上端前内侧骺板，损伤面为总面积的25%～30%，建立骺板损伤模型，生理盐水冲洗后逐层缝合骨膜及皮肤软组织。手动成角组： 麻醉固定方法同“直接刮除法”，右侧膝关节胫骨上端行横向切口，分离开内侧副韧带和软骨膜，捏持膝关节及胫骨，施加外翻应力，使骨骺在骺板软骨水平与干骺端分离呈20～30度角。直视下明确骺板损伤，复位，生理盐水冲洗后逐层缝合骨膜及皮肤软组织。建立胫骨近端Ⅱ型骨骺损伤改良模型。

动物分别于术后4 d、10 d、21 d处死，完整解剖双侧胫骨，行Micro-CT扫描，CTAn （Comprehensive TeX Archive Network）测量大体数据，之后以体积分数10%的甲醛溶液固定，行组织形态学观察。

1.3.2骺板形态的Micro-CT观察双侧胫骨去除附着结缔组织, 将样本固定在Micro-CT系统的检测样本台上, 设置扫描数据，进行粗扫描，然后设置参数，扫描获取图象，扫描完成，调节系统进行2D 及3D的图形重建。得到胫骨近端冠状位图像（此位置图像显示最佳）和3D图像。观察比较扫描结果。

1.3.3标本的大体测量以Micro-CT系统自带的分析软件CTAn测得双侧胫骨长度、胫骨粗隆宽度、胫腓骨之间最宽距离数值，做双侧差值，对样本分析处理采集数据。

1.3.4标本的组织学观察Micro-CT扫描后样本置于体积分数10%甲醛中固定。30% 甲酸脱钙，石蜡包埋，制备成 4 μm 切片后进行HE染色，进行组织学评价。

1.4统计学方法

2　结果

2.1Micro-CT扫描

模型构建4 d，与对照组相比，直接刮除法与手动成角法均可见骺板宽度增加，密度欠均匀，骨骺面及干骺面毛糙，呈轻度波浪状改变，前者还可观察到内侧干骺端处骨质缺损，呈干骺端骨折改变，周围骨质密度减低（图1）。

模型构建10 d，与对照组相比，直接刮除法可见骺板宽度变窄，干骺端骨折处周围骨小梁稀疏，呈骨质疏松改变，有少许骨连接，可能为骨桥。手动成角法可见骺板边界粗糙，骺板宽度增宽，周围骨质密度明显减低（图1）。

模型构建21 d，与对照组相比，直接刮除法可见干骺端骨折处出现显著改变，即骨桥形成，可见骨小梁由干骺端深入骨骺，骺早闭出现。手动成角法可见骺板变窄，内见细小新生骨质成份，干骺端可见迂曲透亮影, 骨膜反应较前减弱（图1）。

2.2组织学观察

模型构建4 d，与对照组相比，直接刮除法可见骺板增宽，内侧骺板成分缺失，成熟软骨细胞体积增大，兼伴有散在基质成分，干骺端骨折区初级骨小梁消失。手动成角法可见骺板成分缺失，大量散在红细胞兼伴有散在基质成分（图2）。

模型构建10 d, 与对照组相比, 直接刮除法骺板损伤区内可见幼稚软骨细胞, 干骺端骨小梁稀疏, 基质增加。手动成角法可见组织细胞肥大、变性, 骺板软骨细胞部分排列紊乱失去柱状结构（图2）。

模型构建21 d，与对照组相比，直接刮除法可见骺板损伤区可见骨性结构，骨小梁由干骺端深入骨骺，骨桥形成，提示骺早闭。手动成角法部分区域可见幼稚软骨细胞，干骺端骨小梁稀疏，基质增加，部分有骨桥形成（图2）。

A： 对照组； B： 直接刮除组； C： 手动成角组图1　动物模型Micro-CT扫描表现A： Control group； B： Direct-injury group；C： Manual-rotation groupFigrue 1　Micro-CT scans to assess changes in epiphyseal plate

2.3各时间点胫骨大体测量

测量结果详见表1～3。

表 1　各时间点大鼠胫骨长度差值比较Table 1　Comparasion of the length of tibia among　different groups in rats　　　　　　　　　　　　　　　　　mm

表 2　各时间点大鼠胫骨粗隆宽度差值比较Table 2　Comparasion of the width of tibial tuberosity among different groups in rats　　　　　　　　　　　　mm

表 3　各时间点大鼠胫腓骨之间最宽距离差值比较Table 3　Comparation of the maximal interval between tibia and fibula among different groups in rats　　mm

3　讨论

按照Kaul等［6］的提议，在一种动物模型中，至少要求具有三种特征，即： 便利、相似、合适。便利指的是容易得到，这是一个选择动物模型的主要标准；相似是指涉及在动物中所研究的现象应与人类的有可比性； 合适则要求其它因素的综合应使某一样本最适合研究某一特殊现象。

目前骺板损伤应用的模型动物有小鼠、大鼠、兔、猪、犬、牛、羊等。其中最常用来制备骺板损伤模型的动物是4～5周龄的大鼠［7-11］和5～6周龄的新西兰兔［12,13］, 同时对它们幼年的骺板特点和骨骺融合时间的研究较为详尽。本实验将这两种方法应用于大鼠, 大鼠的骺板与人类近似, 且其生命周期短, 可以较快的提供研究结果。但是模型建成后的影像检查无论是X线、CT, 还是MRI检查就遇到了瓶颈, 检查部位体积较小会导致影像质量较差, 或者没有相对小的线圈无法进行MRI检查。Micro-CT的高分辨率正好解决了这个问题［14,15］, 其系统自带的CTAn分析软件可以精确的测量各种数据。并且联合HE染色对不同模型制备方法进行比较。

在本实验中直接刮除法损伤骺板累及生长板软骨全层，尤其是骺板静止细胞层和增殖层，易在骨骺与干骺端之间形成纤维血管桥甚至骨桥，导致骺板的早闭 。Micro-CT和HE染色均显示能够良好复制骺板损伤的病变，成功率高，大体测量的数据方面显示出现骨短缩、成角等畸形的状态较为均一。术后4 d和10 d，两种方法没有显著性差异（P＞0.05）； 术后21 d，直接刮除组数据均大于手动成角组（P＜0.05）。直接法制备骺板损伤模型为骺板软骨全层损伤, 缺损较明显，此动物模型虽然与临床上常见的骺板损伤类型不十分吻合，但具有对比研究骺板损伤后变化的价值。而采用手动法制备模型, Micro-CT和HE染色均显示骺板损伤的发展滞后于直接刮除法，改变不及前者明显, 这与骺板血运屏障是否被破坏有关。不同术者在不同时间, 甚至同一术者在不同时间在力量和方向控制上均会有不同程度的差异。因此, 尽管手动成角法与临床损伤时所受的外力复杂情况相近，但缺乏动物实验模型的均一性，很难在实验过程中达到标准的统一。

综上所述，在大鼠骺板损伤模型的构建上，尽管直接刮除法操作较为复杂，但具有相对明确的均一性和稳定的造模成功率。因此该方法更利于对骺板损伤的机制探讨等基础性研究。

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Comparison on Two Models of Epiphyseal Plate Injury in Rat

JING Jin-zhu1, LI Qing-hai2, LV Xue-min3, LIANG Zhen1, WANG Meng1
（1. Beijing Jishuitan Hospital， Beijing Institute of Traumatology and Orthopaedics， Beijing 100035， China；
2. Tai'an No.1 military subarea sanatorium， Shandong Province， Tai'an 271000， China；
3. Department of Pediatric Orthopedic， Beijing Jishuitan Hospital， 100035 Beijing， China）

ObjectiveTo compare two methods for constructing animal models of epiphyseal plate injury, and therefore to learn more about the disease of epiphyseal plate injury. MethodsFourty-five Wistar rats aged between 4-5 weeks were divided into three groups. Group A was control group, without operation； Group B was direct-injury group, in which the upper part of right tibial epihpyseal plate were cut； Group C was manual-rotation group, in which the knees of rats were grabbed valgusly. The rats were sacrificed after 4, 10 and 21days of operation. Micro-CT scanning and histological assessments were done. The differences between the length of left and right tibia, the width of tuberositas of left and right tibiae, and the minimum distance between tibia and fibula were examined by CTAn（Comprehensive TeX Archive Network） software. ResultsMicro-CT scanning and histological assessments showed that, after 4 days of operation, the width of epiphyseal plate were larger in Group B and Group C, immature chondrocytes were found in Group B, and the bone mineral density around operation site were lower than control in Group B. After 10 days of operation, the epiphyseal plate became narrower in Group B, and the bone mineral density around operation site appeared to be lower than normal in Group C. After 21 days of operation, the bone bridge was found in Group B, and only small new-born sclerotin appeared in Group C. According to the length of tibia, the width of tibial tuberosity, and the maximal interval between tibia and fibula, all of these values in Group B and Group C were significantly higher than Group A （control group） （P＜0.05）； but the values after operation of 21 days of Group B were significantly higher than those of Group B （P＜0.05）, other values were not significantly different between the two groups （P＞0.05）. ConclusionIt is proved that the method of direct-injury is a much better one for constructing rat models of epiphyseal plate injury. This method has good stability and variation which more proper for studying disease of epiphyseal plate injury.

Animal model； Micro-CT； Epiphyseal plate injury

Q95-33

A

1674-5817（2015）05-0351-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.05.002

2015-01-22

国家自然科学基金资助课题（30750011）

景金珠（1977-）, 女, 硕士, 主管技师, 主要从事实验动物医学与动物实验教学工作。E-mail： yaoyyy@sohu.com

吕学敏。E-mail： 914278530@qq.com