巨菌草单宁成分的提取和测定

谢焰锋等

摘要：以生长1、2、3个月的巨菌草（Pennisetum sinese）叶片为材料，探讨巨菌草叶片单宁成分的提取方法和含量，单宁提取方法采用正交试验进行优化，单宁含量采用福林酚-比色法进行测定。结果表明，巨菌草单宁最佳提取条件为丙酮体积分数70%，提取温度50 ℃，提取时间1 h。生长1、2、3个月的巨菌草叶片的单宁含量分别为8.47、10.44和12.59 mg/g，与其他牧草相比处于中间水平，且单宁含量随生长时间的延长而增加，不同生长阶段的单宁含量适合不同的动物采食。

关键词：巨菌草（Pennisetum sinese）；牧草；单宁；正交试验

中图分类号：S543+.9；TQ943+.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）17-4250-03

巨菌草（Pennisetum sinese）是福建农林大学菌草生物工程技术研究中心从非洲引进的高产、优质菌草，目前在中国福建、宁夏、广西、浙江、新疆等多个省区和非洲、美洲的许多国家都有推广种植。巨菌草是禾本科狼尾草属（Pennisetum）的植物，可以在热带、亚热带和温带生长，是典型的C4植物，对光照和温度有较高的需求，植株高大，生长快，产量高，抗逆性强[1-3]。巨菌草是多功能草，其用途广泛，可以以草代木种植菌菇，作为生物材料来生产纸张、纤维板、活性炭等，用作生物质能源发电的原材料，也可用作环境恢复和环境保护的优良植物，此外作为牧草饲养畜禽也是它的一个重要用途[4-9]。巨菌草蛋白质含量高，粗蛋白质含量18.64%，精蛋白质含量16.88%，糖分高，总糖含量8.3%，被称为“饲草之王”[1]。巨菌草适口性好，叶片柔软、脆嫩，是牛、马、羊、猪、兔等家畜，鸡、鸭、鹅等家禽和食草性鱼喜爱的饲料[1，10]。

单宁通常被认为是牧草中的抗营养因子，一是由于缩合单宁和蛋白质、维生素、金属离子等络合，导致这些营养物质不能被动物吸收或者利用效率下降；二是单宁味苦具收敛作用，影响饲料的适口性，导致动物的采食量下降；三是单宁会降低动物对养分的消化率并影响营养物质的吸收。巨菌草作为优质牧草，其营养成分已经有相关报道[1，10]，但是作为抗营养因子的单宁成分的提取工艺和含量测定尚未见报道。为了更全面地了解巨菌草作为牧草的优缺点，对不同生长时期巨菌草叶片中的单宁含量进行了综合分析，为更好地利用这一资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

植物材料：供试巨菌草样品采自湖北省武汉市林业果树科学研究所武湖基地，不同生长时期的巨菌草叶片采集后阴干，磨粉，储藏备用。

主要试剂：单宁标准品、福林酚试剂、碳酸钠、丙酮、去离子水。

主要仪器：i-9型双光速紫外/可见分光光度计（海能仪器）。

1.2 方法

1.2.1 植物样品的采集 分别采集生长了1、2、3个月的巨菌草成熟叶片，清洗后自然阴干，磨成粉末备用。

1.2.2 单宁类物质的提取 采用浸提法，以水-有机溶剂混合体系为提取溶剂进行提取。在溶剂提取法中，提取时间、提取温度和溶剂的选择是影响单宁提取率的重要因素。本试验以生长3个月的巨菌草叶片为样品，以丙酮/水为提取溶剂，以提取时间、提取温度和丙酮体积分数进行3因素3水平正交试验（表1），获得最佳提取方法。采用最佳方法，获得其他生长时期的巨菌草叶片的提取液，供单宁含量测定。测定时，准确称取0.5 g样品，加入4 mL提取溶剂，在设定的温度和时间下完成提取，转移出所有提取液，定容到20 mL容量瓶，得到待测溶液。

1.2.3 单宁含量的测定 采用福林酚-比色法测定巨菌草中单宁的含量。标准曲线的制作：精密称取干燥的单宁酸标准品25 mg，用水定容到50 mL容量瓶中，配制成单宁酸溶液。精密量取单宁酸溶液1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 mL分别置于25 mL容量瓶中，加水定容。精密量取各浓度溶液0.5 mL，分别置于10 mL试管中，先加入2.5 mL 10倍福林酚稀释溶液，再加入2 mL 7.5%碳酸钠溶液，摇匀，静置30 min后，在760 nm处测定吸光度，并以吸光度为纵坐标，以质量浓度为横坐标绘制标准曲线。

提取液单宁含量测定：精密量取0.5 mL待测溶液，按照标准曲线的试验方法操作，在760 nm相同条件下测定吸光度，带入回归方程计算出巨菌草叶片中单宁质量浓度，再按公式计算出总单宁含量。其计算公式为：单宁含量（mg/g）=提取液单宁质量浓度×20/原料质量。

1.3 数据处理与统计分析

每个试验组设3个重复，按照正交试验得出的最优方法进行提取，提取液按照标准曲线的试验方法操作，单宁含量测定结果采用ANOVA统计检验。

2 结果与分析

2.1 单宁酸标准曲线和方程

以吸光度（y）为纵坐标，单宁酸质量浓度（x）为横坐标，绘制单宁酸标准曲线，并得出其回归方程和回归系数（图1）。回归方程为：y=9.554 1x+0.028 6，回归系数R2=0.997 9，线性范围为0.02～0.22 mg/mL。

2.2 巨菌草单宁含量正交试验结果

由正交试验结果（表2）可知，因素A（丙酮体积分数）、因素B（提取温度）和因素C（提取时间）的极差分别为2.70、2.28、0.60，因此可知，3因素对单宁含量的影响为丙酮体积分数略大于提取温度，而二者远大于提取时间。从表2还可以看出，因素A以三水平70%最佳，因素B以三水平50 ℃最佳，因素C以一水平1 h最佳。因此提取单宁的最佳提取方法是70%丙酮在50 ℃下提取1 h。

2.3 不同生长阶段巨菌草单宁含量测定

由表3可知，巨菌草叶片单宁含量随着生长时间呈上升趋势，生长1、2、3个月的巨菌草叶片的单宁含量分别为8.47、10.44和12.59 mg/g。

3 讨论

本研究通过正交试验优化了巨菌草单宁提取方法，与李学强等[11]对欧李种壳中单宁提取条件相比，各因素对单宁提取的影响程度均为丙酮体积分数>提取温度>提取时间，对于最佳提取方法，欧李种壳中单宁是用70%丙酮在60 ℃下提取5 h，而本试验是用70%丙酮在50 ℃下提取1 h，可以看出二者所用最佳丙酮体积分数一致；而提取温度略有差异，考虑到丙酮的沸点为56.48 ℃，本研究的50 ℃更为合理；最佳提取时间与文献相比存在差异，考虑到提取时间对得率影响不显著，提取1 h更为经济。

研究测定得到巨菌草生长1、2、3个月时叶片的单宁含量分别为8.47、10.44和12.59 mg/g，高于黑麦草（0.9～1.8 mg/g）[12]、红三叶（1.2 mg/g）[13]、菊苣（1.71 mg/g）[13]，与车前草（14.10 mg/g）[13]、苔草（6.7 mg/g）[14]相当，低于牛角花（46.20 mg/g）[13]、珠芽蓼（120.2 mg/g）[14]、红豆草（13.42～34.48 mg/g）[15，16]、百脉根（20～110 mg/g）[17]。总体来说，巨菌草单宁含量与其他牧草相比处于中间水平。

单宁含量是影响牧草适口性的重要因素，当牧草干物质中的单宁含量达到1%以上时，会出现苦涩味，降低适口性，当含量高于2%时可能会产生阻食作用[16-18]。对肉猪和禽类，饲料单宁含量以0.5%～1.0%为宜[18]；而对于反刍动物，其对单宁耐受性较高，有研究证实3%或5%以内是有益水平[16，17]。巨菌草适口性好，可用于饲喂牛、羊、猪、兔、鹅、鸭等草食畜禽和草食性鱼类。而在生产中一般巨菌草生长1个月较嫩的时候喂养猪、兔和鹅等畜禽，在生长2～3个月时喂养羊、牛等牲畜。本试验证实巨菌草叶片单宁含量在1个月时为8.47 mg/g，即0.85%，较适合饲养肉猪和禽类，在生长2个月和3个月时分别为10.44和12.59 mg/g，即1.04%和1.26%，较适合饲养反刍动物，其变化规律和巨菌草在生产实践中的应用相吻合。

参考文献：

[1] 林兴生，林占熺，林冬梅.不同种植年限的巨菌草对植物和昆虫多样性的影响[J].应用生态学报，2012，23（10）：2849-2854.

[2] 张进国，雷荷仙，黎纪凤，等.巨菌草在不同海拔高度的生长表现[J].贵州农业科学，2013（3）：112-115.

[3] 丁 铭，白 璐，王龙清.巨菌草引进试验及栽培种植技术[J].农村科技，2013（12）：62-63.

[4] 郑金英，陈丽凤，林占熺.菌草产业成长及其多功能性探析[J].中国农学通报，2011，27（1）：304-308.

[5] 肖 正，赵 超，刘 斌.巨菌草高温发酵产沼气的初步研究[J].安徽农学通报，2012，18（17）：18-21.

[6] 邱世海，韦立新，席春燕，等.生物质发电厂燃料适用预处理技术应用现状——以探讨巨菌草的干燥预处理技术为例[J].轻工科技，2012（5）：102-104.

[7] 卢麒麟，唐丽荣，林雯怡，等.巨菌草制备纳米纤维素及其表征[J].草业科学，2013，30（2）：301-305.

[8] 董晓娜，陈喜蓉，钟剑锋，等.巨菌草栽培灵芝试验初探[J].热带林业，2013，41（1）：12-13.

[9] 崔红标，梁家妮，周 静，等.磷灰石和石灰联合巨菌草对重金属污染土壤的改良修复[J].农业环境科学学报，2013，32（7）： 1334-1340.

[10] 程 序，朱万斌.北方农牧交错带以开发能源作物促生态重建的前景[J].草业学报，2012，21（6）：1-7.

[11] 李学强，李秀珍，梦雨轩，等.欧李种壳中单宁提取条件的优化[J].种子，2010（3）：9-12.

[12] OKOBOKI H K， NDLOVU L R， AYISI K K. Chemical and physical parameters of forage legume species introduced in the Capricorn region of Limpopo Province， South Africa[J]. South African Journal of Animal Science，2002，32（4）：247-255.

[13] JACKSON F S， BARRY T N， LASCANO C， PALMER B. The extractable and bound condensed tannin content of leaves from trop icaltree， shrub and forage legumes[J]. J Sci Food Agric， 1996，71：103-110.

[14] 郭彦军，张德罡，龙瑞军，等.高山灌木和牧草缩合单宁含量季节变化动态研究[J].四川草原，2004（6）：3-5

[15] 李素群，吴自立.红豆草中单宁的分光光度法测定[J].草业学报，1993，2（2）：52-55.

[16] 牛菊兰，马文生.红豆草中单宁对过瘤胃蛋白的保护研究[J].草业科学，1995，12（3）：60-62.

[17] BARRY N T， FORSS D A. The content of vegetative lotus condensed tannin pedunculatus， its regulation by fertiliser application， and effect upon protein solubility[J]. J Sci Food， 1983，34：1047-1056.

[18] 牛 锋，赵宗蕃，徐继芳，等.营养酸模中抗营养因子——单宁酸动态变化规律的对比试验研究[J].中国草地，2002，24（3）： 46-51.