F26-T菌株对水稻稻曲病生防效果的初步研究

鄢一笑，刘前刚，杨习群，陈海荣，杜 宇，靳 磊，魏小武，张德元

（湖南省微生物研究院， 湖南 长沙410009）

近年来，湖南省水稻稻曲病发生呈逐年加重的趋势，流行性强，危害严重，不仅造成大量瘪粒病粒，导致稻谷产量及品质下降，而且病粒含有毒素，这种毒素能引起人畜慢性中毒，极大的影响了粮食高产稳产和食品安全[1]。目前，还未发现水稻稻曲病高抗品种，生产上主要依赖爱苗、万兴、好力克等化学农药来防治[2]。尤其是某些农药的毒性大、残留高，对生态平衡和人们的健康产生了较大影响，成为当前防治水稻稻曲病亟待解决的问题[3]。试验从易于定殖到水稻叶部的叶际微生物着手，以期筛选出水稻稻曲病的高效防治菌株，更好地发挥生防微生物的防病潜能，为最终培育出对人畜安全的优质水稻品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

稻曲病病原菌从湖南长沙市郊稻田稻曲病发病植株病穗中采集提取。抗利福平200 μg/m L 和抗病原真菌双标记突变菌株——F26 菌株和F26-T 菌株，由湖南省微生物研究院植保微生物室分离及选育。供试水稻品种为华优451，由湖南湘东种业有限公司提供。供试培养基有：（1）PSA 培养基，马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 m L；（2）PS 培养基，马铃薯200 g、蔗糖20 g、蒸馏水1 000 m L；（3）改良高氏一号培养基（F26 菌株活化培养用），可溶性淀粉20.0 g、KNO31.0 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、NaCl 0.5 g、琼脂20.0 g、蒸馏水1 000 m L；（4）选择抗性培养基（F26-T 菌株选择性培养用），在改良高氏一号培养基中加入利福平溶液，使其在培养基中浓度为200 μg/m L。

1.2 试验方法

1.2.1 F26-T 菌株对水稻稻曲病菌的拮抗作用 参照程明渊等[4]的试验方法，将水稻稻曲病菌（橘黄色稻曲球）接种到PS 培养液中，5～8 d 镜检，待产生分生孢子后，将分生孢子液和冷却至45℃的PSA 混合后倒平板，置培养箱中培养2 d 后，再将供试拮抗菌株点接到平板，每个平板对称点接两个菌株，然后置26℃培养箱中培养，5 d 后观察并记录结果，以平均抑菌带宽、抑菌圈平均直径/拮抗菌落平均直径之比来衡量生防菌的拮抗效果。

1.2.2 F26-T 菌株发酵滤液对稻曲病菌的抗生作用将供试拮抗菌株活化后转接到高氏改良一号培养液中，置28℃，180 r/min 摇床震荡发酵6 d，发酵液经灭菌滤纸过滤，滤液转移至50 m L 离心管，4℃、8 000 r/min 离心15 min，取上清液经0.22 μm 微孔滤膜过滤后备用。将稻曲病菌接种到PS 培养液中，待产生分生孢子后，将分生孢子液和冷却至45℃的PSA 混合倒平板，待平板冷却后，置一无菌牛津杯（内径0.7 cm，高0.9 cm）于平板中心，将300 μL 的F26-T 菌株发酵滤液原液、F26-T 菌株发酵滤液稀释5 倍液和F26-T 菌株发酵滤液稀释10 倍液分别加入到不同的牛津杯中，以5%井冈霉素水剂500 倍稀释液和无菌水为对照，置26℃恒温箱中培养，5 d 后观察并记录各处理的抑菌圈直径。

1.2.3 F26-T 菌株孢子悬液对水稻稻曲病的田间防效 将培养好的放线菌F26 用无菌水稀释制成1.0×106cfu/m L 的孢子悬液，于水稻有穗分化期分3 次连续3 d 喷雾接种孢子悬液，以孢子悬液在水稻叶片上不下滴为宜，以5%井冈霉素水剂500 倍稀释液和无菌水为正负对照，每个处理3 次重复，每个小区8 m2（2 m×4 m），各小区间隔不小于2 m，随机排列。待水稻黄熟期，采用五点取样法，每个重复调查25 丛水稻，调查指标有总稻穗数和病稻穗数，并以病穗数为单位，采用5 级分级法，计算病情指数和防治效果[5]。水稻稻曲病分级标准如下：0 级：无病；1 级：每穗有1个病粒；2 级：每穗有2～4个病粒；3 级：每穗有5～7个病粒；4 级：每穗有8～10个病粒；5 级：每穗有10个病粒以上。

1.2.4 F26-T 菌株在水稻叶围的定殖情况 水稻种子用1%次氯酸钠浸种消毒5 m in，用无菌水漂洗3 次，然后播种，采取常规措施对水稻进行施肥浇灌等田间管理。将培养好的放线菌F26 用无菌水稀释制成1.0×106cfu/m L 的孢子悬液，于水稻有穗分化期分3 次连续3 d 喷雾，以孢子悬液在水稻叶片上不下滴为宜。分别于第3 次喷雾接种后0、1、3、6、9、12 和15 d 采集水稻叶片，取样时兼顾水稻植株上、中和下部叶片。利用抗性选择培养基采用梯度稀释法检测F26-T 菌株在水稻稻叶中的数量，计算单位重量水稻叶片中F26-T菌株的定殖量。

2 结果与分析

2.1 F26-T 菌株对水稻稻曲病菌的拮抗作用

试验结果显示，经PSA 平板对峙培养5 d 后，F26-T 菌株对水稻稻曲病菌的平均抑菌带宽为14.5 mm，其抑菌圈平均直径与拮抗菌落平均直径之比为5.05；而初始菌株F26 对水稻稻曲病菌的平均抑菌带宽为14.7 mm，其抑菌圈平均直径与拮抗菌落平均直径之比为5.12。两菌株的差异不明显，表明F26-T 突变菌株和初始菌株F26 对水稻稻曲病菌具有相同的拮抗作用。

2.2 F26-T 菌株发酵滤液对稻曲病菌的抗生作用

试验结果显示，F26-T 发酵滤液原液的平均抑菌圈直径为25.2 mm，明显优于5%井冈霉素水剂500倍稀释液稀释处理的平均抑菌圈直径（20.1 mm）；F26-T 发酵滤液5 倍稀释液的平均抑菌圈直径为20.5 mm，与5%井冈霉素水剂500 倍稀释液稀释处理的平均抑菌圈直径相当；稀释10 倍的F26-T 发酵滤液平均抑菌圈直径为17.2 mm，稍差于5%井冈霉素水剂500 倍稀释液稀释处理；而无菌水对照处理的平均抑菌圈直径为0 mm。

2.3 F26-T 菌株孢子悬液对水稻稻曲病的田间防效

从表1 中可以看出，无菌水处理的稻曲病病情指数极显著高于其他处理；孢子悬液原液、孢子悬液5倍稀释液和孢子悬液10 倍稀释液对水稻稻曲病的田间相对防效分别为76.93%、66.23%和53.96%；其中，F26-T 菌株孢子悬液原液对水稻稻曲病的田间防效极显著高于5%井冈霉素水剂500 倍稀释液处理；而F26-T 菌株孢子悬液5 倍稀释液和10 倍稀释液对水稻稻曲病的田间防效与5%井冈霉素水剂500 倍稀释液处理无显著性差异。

表1 F26-T 菌株孢子悬液对水稻稻曲病的田间防效

2.4 F26-T 菌株在水稻叶围的定殖情况

由图1 可知，接种后第0～1 天，F26-T 菌落数下降较为明显；第1～6 天，菌落数逐渐增加，并上升至最高；第6～15 天，菌落数逐渐趋于稳定；以接种后第6天的菌落数最多，为8.54×103cfu/m L。因此，F26-T 菌株在水稻叶围定殖情况为：接种后第1 天该菌株数量下降明显，第3～6 天该菌株逐渐适应，并进入生长繁殖期，第9～15 天该菌株在水稻叶围的数量相对稳定。

图1 F26-T 菌株在水稻叶围的定殖情况

3 结论与讨论

研究结果表明，F26-T 菌株对水稻稻曲病病原菌表现出较强的拮抗和抗生作用。该菌株在水稻叶围喷雾接种后第3～6 天就已逐渐适应叶围环境，进入定殖生长阶段，这是其对水稻稻曲病有生防作用的主要原因之一；其孢子悬液原液、5 倍稀释液和10 倍稀释液的田间相对防效分别为76.93%、66.23%和53.96%，效果较为理想。该研究为水稻稻曲病的防治提供了一条新的途径，但该菌株的生防机制以及在其定殖点菌落生长和产素的适宜条件等还需进一步探索。

赵新华等[6]和Nair 等[7]分别从水稻和咖啡叶围成功筛选出芽孢杆菌菌株，这些菌株对水稻白叶枯病菌及多种植物病原真菌均表现出较强拮抗作用。自然界中，水稻（寄主）、病原物（稻曲病病菌）、生防微生物和环境之间的关系是极为复杂的，需明确水稻叶部、穗部生防微生物与病原物及其他生物、分泌物和各种环境因子之间的相互作用及动态变化规律，才能有效地调控无机与有机环境，为生防微生物创造适宜环境，改进其对环境的适应能力，以更好地发挥生防微生物的防病促生等功能。

[1]邹克琴，胡东维，王为民，等.水稻稻曲病的研究进展[J].浙江农业科学，2012，（5）：704-706.

[2]张 舒，张求东，罗汉刚，等.水稻稻曲病的药效试验和防治适期的选定[J].华中农业大学学报，2007，26（2）：178-181.

[3]尹小乐，陈志谊，刘永锋，等.稻曲病拮抗细菌的筛选与评价[J].江苏农业学报，2011，27（5）：983-989.

[4]程明渊，刘洪涛，阎万元，等.人工培养条件下稻曲病菌厚垣孢子产生因素初探[J].吉林农业科学，1996，（2）：62-64．

[5]何明远，张战泓，刘建宇，等.27.12%碱式硫酸铜悬浮剂（铜高尚）防治水稻稻曲病田间药效试验[J].新农药，2006，10（1）：26-27.

[6]赵新华，陈卫良，李德葆，等.白叶枯病菌拮抗菌筛选及水稻叶围微生物互作研究初报[J].中国水稻科学，2000，14（3）：161-164.

[7]Nair JR，Singh G，Sekar V.Isolation and characterization of a novel Bacillus strain from coffee phyllosphere showing antifungal activity[J].JouralofAppiled Microbiology，2002，93（5）：772-880.