微波辅助萃取马齿苋抑菌活性成分的工艺优化

曾秀桃，马佳凤，林 颖，朱 晨，王慧敏，徐丽珊

（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江 金华321004）

马齿苋（Portulaca oleracea L.）为马齿苋科一年生草本植物，别名长命草、五行草、瓜子菜、地马菜等，是我国卫生部划定的87种药食同源的野生植物之一[1]。其干燥地上部分，性寒味酸，具有清热利湿、凉血解毒的功效。目前，已有研究表明马齿苋对多种食品污染菌有较强的抑制作用[2]，以马齿苋为原料，研制新药或天然防腐剂已成为一种趋势。研究马齿苋抑菌效果的前提是有效提取其抑菌活性成分，而目前提取马齿苋抑菌活性成份的相关研究较少。

天然产物中有效成分的传统提取方法有浸渍法[3]、渗漉法[4]、煎煮法和回流提取法[5]等，但这些提取方法存在提取时间长、溶剂用量大、操作麻烦等问题。与传统提取方法相比，微波辅助萃取有提取快速、溶剂用量少、提取率高、成本低、质量好等优点[6]，近年来已广泛用于天然产物中挥发油[7]、多糖[8]、生物碱[9]、黄酮[10]等成分的提取。因此，试验以马齿苋为试验材料，通过单因素和正交试验对其活性成分进行微波辅助萃取研究，旨在获得最佳提取工艺，为马齿苋有效成分在食品、制药等领域的生产应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料与菌种 马齿苋材料购自菜市场，大肠 杆 菌（Escherichia coli）、 金 黄 色 葡 萄 球 菌（Staphyloccocu saureus）、沙门氏菌（Salmonella）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）均由中国药品生物制品检定所提供。

1.1.2 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，琼脂15～20 g/L，pH 值7.4～7.6。

1.1.3 主要仪器 微波消解仪（MDS-8G）、MLS-3750高压蒸汽灭菌锅（日本三洋电机株式会社）、超净工作台（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、恒温生化培养箱（SPX-450）、BPG-9070A 电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）、旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）、电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）、CT 15RE日立台式离心机（天美科学仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 单因素试验 将新鲜马齿苋洗净后烘干至恒重，粉碎备用，以蒸馏水为萃取试剂，以大肠杆菌抑制活性为指标进行单因素试验设计[11]。（1）微波功率：准确称取400.00 g 马齿苋植物材料粉末，料液比1︰50，萃取温度为50℃、时间为12 m in，分别考察500、600、700、800 W 的微波功率对马齿苋抑菌活性物质提取的影响。（2）萃取时间：准确称取400.00 g 马齿苋植物材料粉末，料液比1︰50，萃取温度为60℃、微波功率为500 W，分别考察3、6、9、12、15 m in 的萃取时间对马齿苋抑菌活性物质提取的影响。（3）萃取温度：准确称取400.00 g 马齿苋植物材料粉末，料液比1︰50，微波功率为500 W、萃取时间15 m in，分别考察40、50、60、70℃的萃取温度对马齿苋抑菌活性物质提取的影响。（4）料液比：准确称取400.00 g 马齿苋植物材料粉末，分别考察1︰30、1︰40、1︰50、1︰60、1︰70、1︰80 的料液比，在温度为50℃、萃取时间15 m in，微波功率为500 W 的条件下，马齿苋抑菌活性物质的提取效果。将上述提取液减压抽滤至25 mg/m L（料液比试验抽滤至10 mg/m L），测其对大肠杆菌的抑制直径。

1.2.2 正交试验设计 根据单因素试验结果，选取萃取温度、微波功率、萃取时间3个因素进行L（33）正交试验设计[12]，因素水平选取如表1 所示。并对正交试验所得的最佳组合进行3 次平行试验。

表1 正交试验因素水平

1.2.3 马齿苋活性成分粗品提取产率计算 在最佳工艺条件下微波萃取得活性成分提取液，将其减压浓缩后真空冷冻干燥得抑制大肠杆菌活性成分粗品，按公式（1）计算粗品的提取产率。

其中，ω 表示抑制大肠杆菌活性成分粗品提取产率（%）；x 表示粗提物质量（g）；m 表示植物粉末质量（g）。

1.2.4 马齿苋对细菌的抑制活性及其最小抑菌浓度测定 （1）以蒸馏水为参照，采用牛津杯法[13]测定马齿苋提取液（50 mg/m L）对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、枯草杆菌的抑制活性。（2）分别制备25、12.5、6.25、3.13、1.56 和0.78 mg/m L 的马齿苋活性成分溶液，采用牛津杯法则定其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、枯草杆菌的最小抑菌浓度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 微波功率 由图1 可知，随着微波功率的增加，马齿苋提取液对大肠杆菌的抑制活性呈现先升高后降低的趋势，以700 W 处理得到的马齿苋提取液对大肠杆菌的抑制直径最大，达（16.50±0.63）mm。

图1 不同微波功率获得的马齿苋提取液对大肠杆菌抑制活性的比较

2.1.2 萃取时间 由图2 可知，在萃取3～6 min 时，随着时间的增加，其提取液的抑菌效果不断增强，当萃取6 m in 时，抑菌圈直径达（13.25±0.25）mm；但在萃取6～12 m in 时，萃取时间对马齿苋抑菌效果的影响差异不显著。

图2 不同萃取时间获得的马齿苋提取液对大肠杆菌抑制活性的比较

2.1.3 萃取温度 由图3 可知，随着萃取温度的升高，马齿苋提取液对大肠杆菌的抑制活性呈现先升高后降低的趋势，50℃下获得的马齿苋提取液对大肠杆菌的抑制直径最大，达（13.67±0.46）mm。

图3 不同萃取温度获得的马齿苋提取液对大肠杆菌抑制活性的比较

2.1.4 料液比 由图4 可知，随着料液比比例的增加，提取液的抑菌效果呈现出先增后降的趋势，当料液比为1︰50 时，抑菌圈直径最大，达（12.42±0.08）mm。

图4 不同料液比获得的马齿苋提取液对大肠杆菌抑制活性的比较

2.2 正交试验结果

对表2 的正交试验结果进行极差分析，极差最大的是萃取温度（3.24），表明萃取温度是影响马齿苋抑菌活性成分提取的主要因素；其次是萃取功率（1.91）；而萃取时间对马齿苋抑菌活性成分提取的影响最弱。由此可知，对马齿苋抑菌活性成分提取影响程度从大到小排列依次为：A（萃取温度）＞C（萃取功率）＞B（萃取时间）。由极差数值分析可得，最佳萃取条件组合为：A2B2C3，即萃取温度50℃，萃取时间9 m in，微波功率800 W。

在萃取温度50℃，萃取时间9 min，微波功率800 W，料液比1︰50 的提取条件下，对马齿苋抑菌活性成分进行提取，结果表明，该条件下马齿苋提取物的抑菌直径分别为13.33±0.44、14.16±0.22、13.67±0.17 mm，均比正交试验组合的抑菌直径大，平均值为13.72 mm，标准差为0.42。这表明提取工艺确实为最佳工艺组合。

2.3 最佳提取工艺下马齿苋抑菌活性成分粗品的得率

表2 正交试验结果

取马齿苋植物粉末400.000 g，采用最佳提取工艺（温度50℃，时间9 m in，功率800 W，料液比1︰50）进行微波萃取，最终制得马齿苋提取物63.755 g，经计算其得率为15.94%。

2.4 马齿苋提取物对不同细菌的抑制活性及其最小抑菌浓度

由图5 可知，马齿苋提取物对沙门氏菌和枯草杆菌无抑制作用，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用，其抑菌圈直径分别为13.00±0.87 mm 和11.25±0.38 mm。

图5 马齿苋提取物对不同细菌的抑菌活性比较

从表3 中可以看出，马齿苋提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性随浓度的增大而增强，并且相同浓度的粗提物对不同供试菌的抑制效果不同，马齿苋粗提物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度（M IC）分别为6.25 和1.56 mg/m L。这表明马齿苋对大肠杆菌的抑制效果较强。

3 结论与讨论

马齿苋是一种常见的野菜，在我国分布广泛，资源丰富，储量大且安全无毒[14]，同时该野菜还含有丰富的营养成分及多种药理成分。目前，已被公认是亚麻酸、必需的ω-3 和ω-6 脂肪酸、抗坏血酸、谷胱甘肽、α-生育酚和β-胡萝卜素等营养成分最丰富的来源[15]。该试验也证明其对大肠杆菌有较好的抑制作用，在食品、制药业等领域的应用潜能较大。

表3 不同浓度马齿苋提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制效果

试验以蒸馏水为萃取试剂，以对大肠杆菌的抑制活性为指标，采用单因素和正交试验法优化了马齿苋的提取工艺，获得最佳提取工艺条件为：微波功率800 W，萃取时间9 m in，萃取温度50℃，料液比1︰50。在此条件下，马齿苋提取物得率为15.94%，高于纪丽丽等[16-17]获得的马齿苋多糖提取率（11.74%）和马齿苋总黄酮化合物提取率（11.35%）。这表明该工艺提高了马齿苋中活性物质的提取率，且操作简便效率高，是理想的提取工艺。

对细菌的抑制活性测定结果表明，马齿苋对沙门氏菌和枯草杆菌无抑制作用，但对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有抑制作用，最小抑制浓度（M IC）分别为6.25 和1.56 mg/m L，对大肠杆菌的抑制效果强于金黄色葡萄球菌。

上述研究结果可为合理开发利用植物资源，提高马齿苋的附加值以及马齿苋中抑制细菌物质的分离纯化提供一定参考。

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