基于线粒体Cytb基因全序列的东流水牛群体遗传结构分析

赵拴平,贾玉堂,徐　磊,阮永明

(安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽合肥 230031)

基于线粒体Cytb基因全序列的东流水牛群体遗传结构分析

赵拴平,贾玉堂*,徐磊,阮永明

(安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽合肥 230031)

[目的]分析安徽东流水牛群体遗传结构，为今后开展地方水牛品种研究提供依据。[方法]利用测序技术对31头东流水牛细胞色素b 基因(Cytb)进行序列测定和分析，[结果]发现Cytb基因全长1 140bp，共检测到17个多态位点，构成9种单倍型，单倍型多样度为(0.544±0.107)，核苷酸多样度为(0.00112±0.00091)。同时发现东流水牛Cytb基因具有两种终止密码子AGA和AGG。[结论]东流水牛遗传多样性丰富，且起源于2个母系。

水牛；Cytb；遗传多样性

东流水牛主要分布于安徽省沿江丘陵湖区的东至县、望江县、宿松县和贵池区等地。中心产区东至县位于长江中下游南岸，属于滨湖地区。东流水牛体型高大，体格魁伟，躯干结实，肌肉发达，肉质细嫩，是安徽省优良地方水牛品种，也是中国优良的水牛群体之一[1]。近年来随着农业产业结构的调整，农村劳动力的转移，以及饲养水牛比较效益的下降，加之“以机代牛”，东流水牛的饲养量越来越少[2]，东至县2002年以前东流水牛饲养量达到3.8万头，年出栏量达10 000头以上，到目前为止东流水牛存栏仅6 000余头，其中纯种东流水牛母牛存栏不足1 000头[2]，亟需高度重视。

线粒体DNA细胞色素b(Cytb)基因是唯一一个由mtDNA编码的细胞色素，在线粒体基因组中进化速度适中，包含从种内到种间的进化遗传信息，且在一定的进化尺度内不受饱和效应的严重影响，被广泛用于家畜起源进化、亲缘关系和群体遗传结构研究[3,4]。目前关于东流水牛mtDNA Cytb基因遗传多样性的研究尚未见报道。本研究通过对Cytb基因序列进行测序分析研究，探讨东流水牛的遗传多样性，以期为东流水牛品种资源保护和开发利用提供分子遗传学依据。

1　材料与方法

1.1实验材料

在安徽省池州市东至县采集31头纯种东流水牛血液10 mL，ACD抗凝，低温带回实验室，冻存于-80℃冰箱中备用。利用商业化DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)进行基因组DNA提取。

1.2Cytb基因扩增和测序

利用引物(Cytb-F1：ACCACGACCAATGATATGAAAAACC和Cytb-R1：GAGGTTGGTTGTTCTCCTTTTCTGG)[5]扩增获得水牛Cytb基因序列，扩增条件为：95℃ 5 min→32个循环(95℃ 30 s→58℃30s→72℃1min)→72℃ 5min。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测,用凝胶回收试剂盒进行PCR产物纯化与回收,由上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.3数据处理

利用ClustalX软件进行序列比对，利用MEGA 5.10[6]查找序列的多态位点，利用DnaSP 5.1软件[7]统计核苷酸多样性(Nucleotide diversity)和单倍型多样性(Haplotype diversity)等多态性指标。利用MEGA 5.10软件构建N-J(Neighbor-joining)系统发生树，分析不同单倍型间的进化关系，遗传距离计算采用Maximum Composite Likelihood模型，Bootstrap抽样1 000次。

2　结果与分析

2.1东流水牛Cytb基因的碱基组成

31头东流水牛线粒体Cytb基因全序列长为1 140 bp，无插入和缺失，其序列的平均碱基组成见表1，碱基A、T、G、C的平均含量分别为31.1%、25.0%、13.9%、30.0%，4 种碱基含量差异较大，其中A+T 含量(56.1%)高于G+C 含量(43.9%)。密码子不同位点的碱基组成也存在差异，密码子第1位富含碱基A(29.7%)，第2位富含碱基T(41.0%)，第3位富含碱基A(43.1%)，密码子第1位各碱基组成比例差异不大；但密码子第2位中T 碱基的频率高达41.0%，G碱基仅为13.9%；密码子第3位中A碱基频率高达43.1%，而G碱基仅占6.1%，说明东流水牛Cytb基因密码子第2和第3位都表现出强烈的碱基偏倚性。

表1　东流水牛Cytb基因全序列的平均碱基组成

2.2东流水牛Cytb基因全序列的核苷酸变异

东流水牛Cytb基因全序列核苷酸变异和多态性分析发现，31个水牛个体Cytb基因全序列共检测到17个多态位点，约占核苷酸总数的1.49%，构成9个单倍型，其核苷酸多度样度为(0.00112±0.00091)，单倍型多样度为(0.544±0.107)。17个多态位点中有15个为转换，2个颠换，导致了7个氨基酸的错义突变(图2)，位点分别是6(赖氨酸K→谷氨酸E)、17(丙氨酸A→苏氨酸T)、171(天冬氨酸D→酪氨酸Y)、199(苯丙氨酸F→酪氨酸Y)、238(丙氨酸A→苏氨酸T)、358(酪氨酸Y→组氨酸H)、372(异亮氨酸I→缬氨酸V)。同时发现东流水牛Cytb 基因有两种终止密码子AGA 和AGG。

图1　东流水牛9种单倍型的多态位点　　　　　　图2　东流水牛Cytb基因7个氨基酸错义突变位点

2.3东流水牛NJ系统发育分析

以江河型摩拉水牛序列(EF409940)做外群，构建东流水牛31个个体、9种单倍型的NJ 系统发育树(图3)。图中可以看出，东流水牛9种单倍型聚为两大类，即支系A和支系B，支系A中有8个单倍型，代表30个个体，支系B中只有1个单倍型，代表1个个体。

图3　东流水牛9种单倍型的N-J系统发生树

3　讨论

谢文美等[8]利用测序技术和生物信息学分析技术研究了中国21个水牛群体的遗传变异，发现东流水牛遗传多样性较为丰富，且具有2 个母系起源。齐国强等[9]通过对我国10个地方水牛品种遗传多样性分析，同样发现东流水牛具有较为丰富的遗传多样性。本研究通过对31头安徽东流水牛mtDNA Cytb基因完整序列的测定，发现其17个多态位点导致7个氨基酸的错义突变，表明东流水牛具有丰富的遗传多样性。系统发育研究分析发现，东流水牛9种单倍型聚为A、B两个支系，支系A 是主要支系，支系B只有1个个体，这样的分布模式很可能是由于样本数量少引起的。同时研究发现东流水牛Cytb基因有两种终止密码子AGA 和AGG，这与李世平等[10]在海子水牛和张春梅等[11]在德宏水牛中的研究相一致，表明中国水牛可能具有两种终止密码子AGA 和AGG。

我国家养水牛属于沼泽型水牛，由于其毛色、角形等特征与印度野水牛极为相似，不少中外学者认为中国水牛起源于印度野水牛[1]，但我国考古工作者在全国多处发现有家养水牛驯化的痕迹，说明我国的家养水牛是由我国的先民自己驯化而成[1]，但Kierstein等[12]通过对80头水牛进行遗传多样性分析,提出沼泽型水牛和江河型水牛可能来自于印度次大陆的同一个驯化事件。Lei等[13]对中国7个水牛群体和东南亚水牛进行分析研究，提出沼泽型水牛可能是在中国单独驯化而成。Yue等[14]通过对中国22个地方水牛品种进行分析，证明本地水牛是在中国西南地区驯化而成。Kumar等[15-16]通过系统研究印度江河型水牛的遗传多样性，推测江河型水牛可能是在印度西部驯化的。Mishra等[17]通过分析印度东北部、中国、地中海和东南亚水牛mtDNA，证明部分水牛在印度东北部地区驯化形成，而后传播到东南亚。总之，要彻底弄清中国水牛的起源进化关系，尚需进一步深入研究。

4　小结

本试验研究了我国安徽东流水牛线粒体Cytb基因的遗传多态性及系统进化关系，证明东流水牛线粒体遗传多样性丰富，且具有2个母系起源，为今后开展我国地方水牛品种遗传资源保护和开发利用提供分子遗传学依据。

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Population genetic structure analysis of Dongliu Buffalo by Mitochondrial Cytb Gene Full Length Sequence

ZHANG Shuan-ping,JIA Yutang,XU Lei,RUAN Yong-ming

(InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryResearch,AnhuiAcademyofAgriculturalSciences,Hefei, 230031,China)

【Objective】 The aim of this study was to investigate genetic characteristics of Anhui Dongliu Buffalo, and provide scientific basis for further study of local Buffalo.【Methods】 The full length of mtDNA Cytb gene were sequenced and analyzed from 31 Dongliu buffalo. 【Results】The results showed that the length of the complete mtDNA Cytb sequence was 1140 bp, and 17 polymorphisms and 9 haplotypes were detected. The diversity of nucleotide and haplotype were (0.00112±0.00091) and (0.544±0.107), respectively. Two stop codons, AGA and AGG, were detected in Cytb gene in Dongliu buffaloes. 【Conclusions】The mitochondrial genetic diversity of Dongliu buffalo population was rich, and originated from two matrilines.

buffalo; Cytb; genetic diversity

2015-04-21修改日期:2015-04-30

国家肉牛产业技术体系-合肥综合试验站(CARS-38)，安徽省农业科学院院长青年创新基金项目(14B0428)。

赵拴平(1984-)，女，山西长治人，博士，助理研究员，主要从事肉牛分子育种工作。E-mail:zhaoshuanping@163.com。

贾玉堂(1962-)，男，副研究员，主要从事草食动物遗传育种工作。E-mail:yutang2018@163.com 。

S823.2

A

1001-9111(2015)05-0015-04