外源抗氧化剂对荔枝酒发酵的影响研究

张　斌，罗帝洲，郑　倩，吴湃泳（惠州学院生命科学系，广东惠州516007）

外源抗氧化剂对荔枝酒发酵的影响研究

张斌，罗帝洲，郑倩，吴湃泳
（惠州学院生命科学系，广东惠州516007）

为了解决过量二氧化硫影响果酒品质的问题，探索二氧化硫的取代物，考察了添加二氧化硫、抗坏血酸、异抗坏血酸、谷胱甘肽和乙二胺四乙酸（EDTA）对荔枝酒中多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、总糖、总酸、酒精度、杂醇淮和总酯的影响。结果显示，添加抗氧化剂有利于抑制酶活、促进香气物质的生成。在抗氧化剂添加量为250 mg/L时，添加异抗坏血酸比添加SO2的酒样中PPO酶活、POD酶活、总糖分别降低了70.0%、66.7%、79.4%，而酒精度、杂醇淮、总酯分别提高了3.8%、16.5%、61.4%；添加EDTA比添加SO2的酒样中PPO酶活、POD酶活、总糖分别降低了60.0%、58.3%、75.0%，而酒精度、杂醇淮、总酯分别提高了1.9%、10.8%、57.1%。研究表明，添加异抗坏血酸或乙二胺四乙酸可以部分的取代二氧化硫，有利于提升荔枝酒的品质。

荔枝酒；抗氧化剂；多酚氧化酶；过氧化物酶

荔枝酒的氧化褐变严重影响荔枝酒的品质，多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和过氧化物酶（peroxidase，POD）是引起果酒酶促氧化褐变的关键酶，多酚氧化酶是一种含铜氧化酶，可将多酚氧化为醌，醌类物质发生聚合会产生类黑色素，过氧化物酶（peroxidase，POD）可促进酚类物质和蛋白质反应产生沉淀［1-4］。果酒在传统酿造中允许添加少量的二氧化硫作抗氧化剂、防腐剂和抑菌剂等。中国国家标准中规定葡萄酒中二氧化硫最大使用量为250 mg/L，过量的二氧化硫会影响酒的品质，会对人体健康造成危害，故探索合适的二氧化硫取代物尤为重要。

通过添加适量抗氧化剂可以抑制果酒的氧化褐变，提高果酒的品质。范远景等［5］研究发现，抗氧化剂的作用要点是降低介质含氧量和氧的活化度，延长诱导期的时间，诱导期后加入的抗氧化剂则效果不佳；曹绪章［6］发现在含金属离子的溶液中加入乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）可以明显加强防腐抑菌能力；SCHNEIDER V［7］研究发现维生素C及其钠盐在添加浓度较低时，其表现出抗氧化性，超过一定量后反而表现出促氧化作用而加速褐变。

本实验研究了二氧化硫（SO2）、抗坏血酸（vitamin C，VC）、异抗坏血酸（异VC）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和EDTA对荔枝酒发酵的影响，对荔枝酒中的PPO、POD、总糖、总酸、酒精度、杂醇淮和总酯进行检测分析，探索了取代二氧化硫的可行性。国标GB 2760—2011《食品添加剂使用标准》中规定发酵果酒中抗氧化剂的最大添加量为1 000 mg/L，本实验通过研究4种抗氧化剂对荔枝酒发酵的影响，并与二氧化硫的作用效果进行比较，确定可有效取代二氧化硫的物质，为果酒行业降低二氧化硫使用量提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

荔枝冷冻汁：广东祯州集团有限公司；抗坏血酸、异抗坏血酸、谷胱甘肽、乙二胺四乙酸、食品级亚硫酸、邻苯二酚、愈创木酚、过氧化氢、磷酸缓冲液、乙醇：国药集团化学试剂有限公司；甲醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇均为色谱纯：上海阿拉丁试剂有限公司。

1.2仪器与设备

6890N气相色谱仪-5975质谱仪：美国Agilent公司；顶空固相微萃取装置（聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）萃取头100 μm）：美国Supelco公司；UV-7504紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司。

1.3实验方法

1.3.1荔枝果酒发酵工艺流程

荔枝汁→成分调整（调糖、酸）→接种酵母菌（250 mg/L）→添加抗氧化剂（100～300 mg/L）→酒精发酵→过滤→陈酿→成品

1.3.2杂醇淮的顶空固相微萃取-气相色谱-质谱条件［8-12］

（1）顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）

在15 mL顶空样品瓶中添加10 mL白兰地酒样，在磁力搅拌器作用下于50℃平衡10 min，将微萃取纤维100 μm的PDMS在250℃老化处理2 h，再于50℃顶空萃取40 min，再在230℃脱附3 min，待检。

（2）气相色谱-质谱操作条件

气相色谱条件：DB-1色谱柱（30.0m×0.25mm×0.25μm），柱温为程序升温：先45℃保持1 min，再以3℃/min的速度升温至55℃，保持1 min，再以10℃/min的速度升温至120℃，保持10 min后再升温到200℃。进样口温度为230℃，载气为氦气（He），流速1 mL/min，不分流。

质谱条件：电离方式电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，检测器电压为350 V，离子源温度230℃，接口温度280℃，以35～335 amu为扫描质量范围。

（3）数据处理

以保留时间进行定性，外标峰面积法进行定量。

1.3.3标准溶液的配制

准确称取甲醇20.0 mg、丙醇30.0 mg、正丁醇40.0 mg、异丁醇40.0 mg、异戊醇40.0 mg，用体积分数40%乙醇水溶液溶解并定容至10 mL，混匀，密封后置于冰箱中保存，使用时用体积分数40%乙醇水溶液稀释10倍。

1.3.4理化指标测定方法

总糖、总酸和酒精度等常规理化指标测定采用国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，总酯测定方法参照国标GB/T 10345—2007《白酒分析方法》。

1.3.5 PPO活性测定［13］

取荔枝汁在12 000 r/min离心10 min，取上清液作为粗酶液。加入1 mL 0.1 mol/L邻苯二酚，1.95 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液，取0.05 mL上清液迅速摇匀，测定波长410 nm处每分钟的吸光度值变化，以每分钟△OD410nm变化0.001表示一个酶活力单位（U），酶活性表示为U/mL。

1.3.6 POD活性测定［13］

取荔枝汁在12 000 r/min离心10 min，取上清液作为粗酶液。加入0.1 mL4.0%愈创木酚、0.1 mL0.46%过氧化氢和2.7 mL 0.15 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0），取0.1 mL粗酶液迅速摇匀，静置5～8 min，测定波长470 nm处的吸光度值变化，以每分钟△OD470nm变化0.01表示一个酶活力单位（U），酶活性表示为U/mL。

2　结果与分析

2.1 PPO活性分析

各种抗氧化剂对PPO酶活的影响见图1。

图1　抗氧化剂对PPO酶活的影响Fig.1 Effect of antioxidant on PPO activity

从图1可以看出，随着抗氧化剂添加量的增加，各酒样的PPO酶活基本呈现降低的趋势。当抗氧化剂添加量为100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L和300 mg/L时，添加异VC比添加SO2的酒样中PPO酶活分别降低了25.0%、33.3%、72.7%、70.0%和55.6%；添加EDTA比添加SO2的酒样中PPO酶活分别降低了18.8%、25.9%、63.6%、60.0%和44.4%；添加谷胱甘肽比添加SO2的酒样中PPO酶活分别降低了9.4%、7.4%、27.3%、15.0%和11.1%。添加VC比添加SO2的酒样中PPO酶活分别提高了9.4%、11.1%、9.1%、14.0%和22.2%。

几种物质中异VC对PPO酶的抑制性最强，VC与其他抗氧化剂相比效果不明显，VC及其钠盐在果酒中既有抗氧化作用，又有过氧化作用。当质量浓度较低时，表现出抗氧化性，随着质量浓度的增加，反而表现出促氧化作用而加速果酒褐化。异VC影响酶活性是竞争性地消耗氧，且可使酚类的第一步氧化逆转，即将醌转化为相应的酚而延缓氧化的启动。异VC可以有效抑制荔枝酒中PPO酶活，并在添加量为200 mg/L时达到最大的抑制效果。

2.2 POD活性分析

各种抗氧化剂对POD酶活的影响见图2。

图2　抗氧化剂对POD酶活的影响Fig.2 Effect of antioxidant on POD activity

由图2可知，随着抗氧化剂添加量的增加，各酒样的POD酶活基本呈现降低的趋势。当抗氧化剂添加量为100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L时，添加异VC比添加SO2的酒样中POD酶活分别降低了29.2%、54.5%、81.3%、66.7%、70.0%；添加EDTA比添加SO2的酒样中POD酶活分别降低了16.7%、36.4%、62.5%、58.3%、50.0%。金属离子在价态发生变化过程中起传递电子的作用，可缩短链引发期的时间，从而加快了氧化褐变速度，EDTA能与金属形成隋性的络合物，抑制了氢过氧化物的分解，抑制自由基生成，从而起到抑制氧化褐变的作用。可见，异VC对POD酶的抑制效果最强，对果酒的抗氧化效果最好，其次是EDTA。

2.3总糖含量分析

添加不同抗氧化剂进行酒精发酵结束后所得荔枝酒的总糖含量结果见图3。

图3　抗氧化剂对总糖含量的影响Fig.3 Effect of antioxidant on total sugar content

由图3可知，随着抗氧化剂量的增加，总糖含量基本呈现递减的趋势。除VC和SO2外，添加抗氧化剂均促进了总糖的减少，例如，当抗氧化剂添加量为100mg/L、150mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L时，添加EDTA比添加SO2的酒样中总糖含量分别降低了51.9%、54.4%、59.4%、75.0%和84.8%；添加异VC比添加SO2的酒样中总糖含量分别降低了53.8%、56.4%、54.7%、79.4%和85.4%；添加谷胱甘肽比添加SO2的酒样中总糖含量分别降低了39.4%、37.8%、37.5%、50.0%和65.0%。添加EDTA、异VC和谷胱甘肽均能有效促进总糖的消耗，添加量增加时的促进效果也增加。果酒中总糖尤其是还原糖和氨基化合物（氨基酸和蛋白质）间会发生美拉德反应，促进果酒氧化褐变，总糖的消耗可以有效避免果酒的褐变。

2.4总酸含量分析

酸类物质是荔枝酒中的重要物质，主要含有柠檬酸、苹果酸和酒石酸等有机酸，可促进多糖和果胶物质的分解，加速酒体的澄清，赋予果酒怡悦的鲜爽感等。抗氧化剂对总酸含量的影响见图4。

图4　抗氧化剂对总酸含量的影响Fig.4 Effect of antioxidant on total acid content

由图4可知，总酸含量基本呈现先降低后升高的趋势，总酸含量变化为8～10 g/L。添加谷胱甘肽与SO2相比，可以在一定程度上抑制酸类物质的过量生成，例如，在添加量分别为150mg/L、200mg/L、250mg/L和300mg/L时，添加谷胱甘肽比添加SO2的酒样中总酸含量分别降低了0.29%、0.81%、2.51%和2.42%。可见，除谷胱甘肽可以抑制总酸生成外，其他物质对总酸的影响不明显，并会在一定程度上促进总酸的生成。葡萄糖和果糖在酸性条件下容易发生分解反应生成5-羟甲基糠醛，从而引起非酶褐变。

2.5酒精度含量分析

各酒样的酒精度随抗氧化剂添加量的变化见图5。

图5　抗氧化剂对酒精度的影响Fig.5 Effect of antioxidant on alcohol content

由图5可知，各酒样的酒精度随抗氧化剂添加量的增加基本呈现递增的趋势，但添加VC除外，VC对氧有极强的亲和力，很容易被氧化成为脱氢抗坏血酸，从而消耗果酒中的溶解氧，酵母菌在前期的繁殖生长过程中需要氧，氧的不足抑制了酵母菌的大量繁殖，从而降低了酵母菌转化酒精的能力。当添加量为100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L时，添加EDTA比添加SO2的酒样中酒精度分别提高了4.9%、6.0%、2.6%、1.9%、5.5%；添加异VC时分别提高了4.7%、5.6%、2.4%、3.8%、6.2%；添加谷胱甘肽时分别提高了3.0%、3.0%、1.8%、0.87%、3.2%。但是，添加VC量为200 mg/L、250 mg/L和300 mg/L时，比添加SO2的酒样中酒精度分别降低了8.9%、7.8%和9.3%。可见，添加异VC的酒精度最高，而添加VC的酒精度最低。添加异VC可有效提高荔枝酒中的酒精得率，促进发酵。果酒的酒精度越高，越有利于抑制酒体发生氧化褐变。

2.6杂醇淮含量分析

果酒中的杂醇淮主要包括正丙醇、正丁醇、异丁醇和异戊醇，适量可以增加酒体的厚重感［14-16］。各抗氧化剂对酒样中杂醇淮含量的影响见图6。

图6　抗氧化剂对杂醇淮含量的影响Fig.6 Effect of antioxidant on fusel oil content

由图6可知，随着抗氧化剂添加量的增加，杂醇淮含量基本呈现递增的趋势，变化区间在0.20～0.45 g/L，均在合适的范围之内。抗氧化剂添加量为100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L时，添加EDTA比添加SO2的酒样中杂醇淮含量分别提高了31.4%、40.8%、15.4%、10.8%和15.3%；添加异VC比添加SO2的酒样中杂醇淮含量分别提高了35.6%、34.6%、17.5%、16.5%和18.1%。但是，添加VC量分别为100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L时，比添加SO2的酒样中杂醇淮含量分别降低了6.8%、7.7%、24.6%、20.5%和11.1%。由此可见，添加EDTA或异VC有利于杂醇淮在合适范围内的生成，增加果酒的厚重感。异VC在果酒中因容易被氧化而消耗溶解氧，从而减少了杂醇淮发生氧化反应生成醛和酸的机会；EDTA能与金属形成隋性的络合物，从而减少了金属作为催化剂催化氧化反应和酯化反应等发生的机会，一定程度上抑制了杂醇淮的氧化，使杂醇淮保持在合适范围内。

2.7总酯含量分析

酯类物质是荔枝酒中的主要香气物质，酯类的产生主要依赖酵母菌的代谢活动，由酸类物质先生成酰基辅酶A，再与醇类物质进行酯化反应而生成［17-18］。各酒样的总酯含量变化结果见图7。

图7　抗氧化剂对总酯含量的影响Fig.7 Effect of antioxidant on total ester content

由图7可知，总酯含量基本随抗氧化剂的增加呈现递增趋势。在抗氧化剂添加量为100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L时，添加EDTA比添加SO2的酒样中总酯含量分别提高了21.2%、51.8%、47.2%、57.1%和59.7%；添加异VC比添加SO2的酒样中总酯含量分别提高了22.0%、42.9%、37.1%、61.4%和66.7%。由此可见，添加异VC或EDTA有利于荔枝酒中酯类物质的生成。在酯化反应中，醇作为亲核试剂对羧基的羰基进行亲核攻击，在质子酸存在时，羰基碳更为缺电子而有利于醇与他发生亲核加成。添加异VC或EDTA可以促进果酒中酸类物质的生成，从而对酯化反应起到促进作用，提升果酒中酯类物质的含量。

3　结论

荔枝酒发酵过程中与添加二氧化硫相比，添加EDTA或异VC可促进总糖的消耗及较高的酒精度，有利于杂醇淮在合适范围内的生成及酯类物质的合成，但对总酸影响不明显。异VC对PPO酶和POD酶的抑制性最强，当添加量为200mg/L时对PPO酶达到最大的抑制效果。因此，添加EDTA或异VC可以部分的取代二氧化硫，作为荔枝酒发酵的抗氧化剂。

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Effect of exogenous antioxidant on litchi wine fermentation

ZHANG Bin，LUO Dizhou，ZHENG Qian，WU Paiyong
（Department of Life Science，Huizhou University，Huizhou 516007，China）

In order to solve the problem that excess sulfur dioxide influenced the quality of fruit wine，substitute of sulfur dioxide was researched.The effects of glutathione and ethylene diamine tetraacetic acid（EDTA）on polyphenol oxidase（PPO），peroxidase（POD），total sugar，total acid，alcohol content，fusel oil and total ester of litchi wine was investigated.The results showed that antioxidant addition could inhibit enzyme activity and promote the formation of aroma substances.When the antioxidant addition was 250 mg/L，comparing with wine adding SO2，PPO enzyme activity，POD enzyme activity and total sugar of wine adding erythorbic acid reduced by 70.0%，66.7%and 79.4%，respectively，but alcohol content，fusel oil，total ester increased by 3.8%，16.5%and 61.4%，respectively.PPO activity，POD activity and total sugar of wine adding EDTA was reduced by 60.0%，58.3%and 75.0%，respectively，but alcohol content，fusel oil，total ester increased by 1.9%，10.8%and 57.1%，respectively.The study indicated that erythorbic acid or EDTA could partly replace sulfur dioxide for improving litchi wine quality.

litchi wine；antioxidant；polyphenol oxidase；peroxidase

TS262.6

A

0254-5071（2015）11-0131-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.030

2015-09-29

国家自然科学基金（21376094）；惠州学院科研基金（hzux1201416）

张斌（1979-），男，讲师，博士，主要从事果葡酒酿造和食品绿色加工工作。