枯草芽孢杆菌NKY1145高密度发酵工艺条件的优化

李　达，牛春华，姜媛媛，王景会*（吉林省农业科学院农产品加工研究所，吉林长春130033）

枯草芽孢杆菌NKY1145高密度发酵工艺条件的优化

李达，牛春华，姜媛媛，王景会*
（吉林省农业科学院农产品加工研究所，吉林长春130033）

通过单因素试验及正交试验，对枯草芽孢杆菌NKY1145发酵工艺条件进行了优化，并进行发酵罐5 L、50 L放大培养对优化工艺参数验证。确定了枯草芽孢杆菌NKY1145摇瓶发酵罐工艺参数为发酵温度37℃，初始pH值为7.0，接种量15%，转速250 r/min。在此最佳发酵条件下，菌液OD600nm值为3.24。在5 L、50 L发酵罐放大培养条件下，菌液OD600nm值分别为3.18、3.30，验证了枯草芽孢杆菌发酵工艺参数优化组合的稳定性，为以后工业化生产提供了有力的借鉴。

枯草芽孢杆菌NKY1145；高密度发酵；条件优化

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtlis）属于芽孢杆菌属的一种，其广泛分布于土壤及其腐败的有机物中，并喜欢在枯草浸泡液中繁殖［1-3］。中国农业部允许枯草芽孢杆菌作为饲料添加剂使用，并重点应用于微生态试剂方面。因其无毒无残留和无污染等特点，具有广阔的发展前景［3-6］。

目前已有一些对枯草芽孢杆菌益生菌高密度培养的研究报道，但仅限于实验室规模的小试水平，没有大规模中试水平的报道［7-8］。本研究在枯草芽孢杆菌NKY1145高密度培养基研究的基础上，对摇瓶高密度生产工艺进行研究，并进一步采用中试规模放大培养验证高密度培养工艺条件。为枯草芽孢杆菌NKY1145高密度发酵的工业化提供了重要的前期试验数据和工艺条件参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌种

供试菌种为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NKY1145：由吉林省农业科学院农产品加工研究所保藏提供。

葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、柠檬酸钠、硫酸镁均为分析纯：北京奥博星生物技术有限责任公司；糖蜜、黄豆粉：市售。

1.1.2培养基

基础培养基：葡萄糖2%，糖蜜3%，酵母粉3%，蛋白胨3%，黄豆粉2%，氯化钠3%，硫酸镁2%，柠檬酸钠3%。

1.2仪器与设备

GUCZ5-50机械搅拌发酵罐：镇江东方生物工程设备技术有限公司；MLS-3780高压灭菌器：日本Sanyo公司；Cary300紫外可见分光光度计：美国Varian公司。

1.3试验方法

1.3.1摇瓶发酵温度对微生物OD600nm值的影响［9］

选取22℃、27℃、32℃、37℃、42℃5个温度作为摇瓶发酵温度，在初始pH 7.0、接种量5%、装液量150 mL/500 mL、转速200 r/min条件下培养24 h，测定其OD600nm值。

1.3.2摇瓶初始pH值对微生物OD600nm值的影响［10］

将培养基的初始pH使用1 molL/L HCl溶液调至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，在装液量150 mL/500 mL、接种量5%、温度37℃、转速200 r/min条件下培养24 h，测定其OD600nm值。

1.3.3摇瓶接种量对微生物OD600nm值的影响［11］

选取接种量1%、3%、5%、10%、15%，在初始pH 7.0、装液量150 mL/500 mL、温度37℃、转速200 r/min条件培养24 h，测定其OD600nm值。

1.3.4摇瓶摇瓶转速对微生物OD600nm值的影响［12］

选取100r/min、150r/min、200r/min、250r/min、300 r/min 5个转速，在初始pH 7.0、接种量5%、装液量150 mL/500 mL、温度37℃培养条件下培养24 h，测定其OD600nm值。

1.3.5摇瓶工艺参数正交试验优化［13］

在摇瓶单因素试验工艺优化的基础上，进行工艺参数（发酵温度、接种量、初始pH、转速）4因素3水平正交试验，培养24 h，测定发酵液OD600nm值。

1.3.6 5 L、50 L发酵罐试验验证

在摇瓶发酵工艺优化的基础上，进行5 L、50 L发酵罐的扩大培养，发酵培养条件为摇瓶发酵优化培养工艺条件，每2 h测定发酵液OD600nm值，绘制其生长曲线。对比摇瓶、5 L和50 L发酵生长曲线，验证优化发酵工艺的稳定性。

1.3.7数据统计分析

每组试验3个平行，采用SPSS 12.0进行统计学分析。

2　结果与分析

2.1发酵温度对微生物活菌量的影响

图1　不同发酵时间对枯草芽孢杆菌发酵液的影响Fig.1 Effect of different fermentation time on the fermentation broth ofB.subtilis

由图1可知，低温和高温对枯草芽孢杆菌NKY1145生长都有不同程度的影响，温度过高过低都会对枯草芽孢杆菌生长造成延迟，生物合成量降低等不良现象［14］。在22～37℃温度范围内，随着温度的升高，菌种培养液OD600nm值升高，各温度控制点培养24 h后的发酵液OD值呈现显著性差异。在37℃时OD600nm值最大，该温度为最适发酵温度。当发酵培养温度为42℃时，菌种培养液OD600nm值开始略有下降，37℃培养24 h后菌液OD600nm值与42℃培养的菌液OD600nm值相互之间不呈现显著性差异，考虑到工艺能耗与成本方面，因而枯草芽孢杆菌NKY1145的最适发酵温度为37℃左右。

2.2初始pH值对微生物活菌量的影响

图2　不同初始pH值对枯草芽孢杆菌发酵液的影响Fig.2 Effect of different initial pH on the fermentation broth of B.subtilis

由图2可知，在初始pH值为5.5～7.0时，枯草芽孢杆菌NKY1145发酵液OD600nm值随初始pH值的增加而增加，初始pH值为5.5～6.0时，两组发酵液之间OD600nm值不呈显著性差异，但初始pH值为7.0时，与其他初始pH组OD600nm值呈现显著性差异，当培养液初始pH值为7.5时，发酵液OD600nm值开始明显下降，且与初始pH 7.0组OD600nm值呈现显著性差异。因此，枯草芽孢杆菌NKY1145最适初始pH值为7.0左右。

2.3接种量对微生物活菌量的影响

图3　不同接种量对枯草芽孢杆菌发酵液的影响Fig.3 Effect of different inoculum on the fermentation broth of B.subtilis

由图3可知，在接种量1%～10%时，随着接种量的增加，其发酵菌液OD600nm值升高，接种量＞10%后，枯草芽孢杆菌NKY1145发酵液OD600nm值开始略有下降，但接种量为15%发酵液OD600nm值与接种量10%发酵液OD600nm值没有呈显著性差异，从生产成本角度考虑，枯草芽孢杆菌NKY1145的最适接种量为10%。

2.4摇瓶转速对微生物活菌量的影响

枯草芽孢杆菌NKY1145生长过程需要氧气的参与，通过改变摇瓶转速可以调节发酵液中含氧量。摇瓶转速过低，发酵液中含氧量小，不利于菌体生长，摇瓶转速过高时，产生的剪切力对菌体破坏，不利于菌体生长［15-16］。由图4可知，转速在100～250 r/min时，随着转速的提高，发酵液OD600nm值升高，转速达到250 r/min时，发酵液OD600nm达到最高。转速为300 r/min时，发酵液OD600nm值开始下降，但与转速250 r/min组发酵液OD600nm值没有呈现显著性差异。从生产工艺、能耗及其高转速对设备磨损角度，枯草芽孢杆菌NKY1145的最适摇瓶转速为250 r/min。

图4　不同摇瓶转速对枯草芽孢杆菌发酵液的影响Fig.4 Effect of different shake flash rotation speed on the fermentation broth ofB.subtilis

2.5摇瓶工艺参数正交试验优化

在摇瓶单因素发酵工艺参数优化基础上，进行工艺参数正交试验，确定枯草芽孢杆菌NKY1145摇瓶发酵工艺最佳组合。

表1　摇瓶发酵工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation technology optimization in shake flask

由表1可知，摇瓶发酵工艺各因素对结果的影响顺序为D＞A＞B＞C，即转速＞发酵温度＞初始pH值＞接种量。摇瓶发酵工艺最佳组合为A2B2C3D2，即发酵温度37℃，初始pH值为7.0，接种量15%，转速250 r/min。在此最佳条件下进行验证试验，OD600nm值为3.24。

2.6 5 L、50 L发酵罐试验验证优化工艺

图55　 L与50 L发酵罐工艺参数验证Fig.5 Validation of process parameters for 5 L and 50 L fermenter

在摇瓶发酵工艺优化的基础上，进一步扩大培养规模（5 L、50 L发酵罐），验证工艺参数组合稳定性。由图5可知，枯草芽孢杆菌NKY1145在5 L发酵罐菌株生长曲线与50 L发酵罐菌株生长曲线发酵周期基本一致，5 L、50 L发酵罐发酵18 h后OD600nm值达到最高值分别为3.18和3.30，与摇瓶发酵结果OD600nm值3.24基本相符，从而验证了摇瓶发酵罐工艺参数优化组合在5 L和50 L发酵罐中的稳定性。

3　结论

通过摇瓶单因素试验及正交试验，确定了枯草芽孢杆菌NKY1145发酵工艺参数为发酵温度37℃，初始pH值为7.0，接种量15%，转速250r/min。在摇瓶发酵工艺参数优化的基础上，通过5 L、50 L发酵罐放大培养，得到发酵液OD600nm值基本与摇瓶发酵液OD600nm相符合，验证了高密度发酵工艺在5 L、50 L规模生产条件下的稳定性，为下一步产业化发酵生产枯草芽孢杆菌NKY1145提供了良好的前期基础。

［1］丁明亮，欧阳安然，王望斐，等.枯草芽孢杆菌产凝乳酶发酵条件的优化［J］.食品科学，2011，32（3）：156-160.

［2］杨锋，章亭洲.枯草芽孢杆菌生物学特性的研究［J］.饲料研究，2011（3）：34-36.

［3］叶云峰，黎起秦，袁高庆，等.枯草芽孢杆菌B47菌株高产抗菌物质的培养基及发酵条件优化［J］.微生物学通报，2011，38（9）：1339-1346.

［4］王宗伟，李法增，杨志平，等.枯草芽孢杆菌在畜禽营养上的研究进展［J］.中国畜牧杂志，2015，41（1）：80-83.

［5］张爱武，薛军.枯草芽孢杆菌在动物生产中的应用效果［J］.中国畜牧兽医，2011，38（4）：234-238.

［6］谢凤行，赵玉洁，周可，等.产胞外淀粉酶枯草芽孢杆菌的分离筛选及其紫外诱变育种［J］.华北农学报，2009，24（3）：78-82.

［7］李明，双宝，李海涛，等.枯草芽孢杆菌的研究与应用［J］.东北农业大学学报，2009，40（9）：111-114.

［8］刘雪，叶婧，穆长青，等.枯草芽孢杆菌B-332菌株发酵条件的研究［J］.中国农学通报，2012，28（10）：230-235.

［9］郭夏丽，狄源宁，王岩.枯草芽孢杆菌产芽孢条件的优化［J］.中国土壤与肥料，2012（3）：99-103.

［10］甄静，郭直岳，谢宝恩，等.枯草芽孢杆菌XK-1产芽孢条件的优化［J］.中国农学通报，2012，28（27）：146-151.

［11］代阳，魏利，王继华，等.枯草芽孢杆菌发酵条件优化及其破乳效能［J］.微生物学通报，2010，37（4）：580-585.

［12］翟继鹏，张金枝.枯草芽孢杆菌在养殖业中的应用研究进展［J］.浙江畜牧兽医，2010（3）：7-9.

［13］周映华，吴胜莲，贺月林，等.饲用枯草芽孢杆菌发酵条件的优化［J］.湖南农业科学，2010（11）：21-23.

［14］姚小飞，叶璐，赵世敏.枯草芽孢杆菌的选育及其发酵豆粕的工艺条件研究［J］.安徽农业科学，2010，38（16）：8476-8478，8490.

［15］赵达，刘伟成，裘季燕，等.枯草芽孢杆菌B03液体发酵条件的优化［J］.华北农学报，2008，23（2）：205-209.

［16］沈智华，沈锦玉，尹文林，等.枯草芽孢杆菌B115优化培养及其对气单胞菌的抗菌效果的研究［J］.微生物学通报，2005，32（4）：79-84.

Optimization of high density fermentation conditions ofBacillus subtlisNKY1145

LI Da，NIU Chunhua，JIANG Yuanyuan，WANG Jinghui*
（Institute of Agro-Food Technology，Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130033，China）

The fermentation conditions ofBacillus subtilisNKY1145 were optimized by single factor experiments and orthogonal experiments and the optimal conditions were verified by 5 L and 50 L fermenter enlarge cultivations.The optimal conditions of shake flash cultivation ofB.subtilis NKY1145 were temperature 37℃，pH 7.0，inoculum 15%，rotation speed 250 r/min.Under this condition，OD600nmof fermentation liquid was 3.24.In the 5 L and 50 L fermenter enlarge cultivations，OD600nmof fermentation liquid was 3.18 and 3.30.The stability of the optimal fermentation conditions were indicated，which provided a powerful reference for later industrialized production.

Bacillus subtlisNKY1145；high density fermentation；conditions optimization

TS201.3

A

0254-5071（2015）11-0075-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.017

2015-09-21

吉林省科技厅重点科技攻关项目（200150204080NY）；吉林省农业科技创新工程项目（ZYCX201315）；吉林省科技发展计划（20150307019NY）

李达（1980-），男，助理研究员，硕士，主要从事农产品加工工作。

王景会（1976-），女，研究员，博士，主要从事农产品加工工作。