丹参总酚酸抑制酪氨酸酶机理研究

宋基正，李凌军，孙　鹏，王　朋

（山东中医药大学药学院山东济南250355）

·基础研究·

丹参总酚酸抑制酪氨酸酶机理研究

宋基正，李凌军，孙鹏，王朋

（山东中医药大学药学院山东济南250355）

目的：研究丹参总酚酸、总丹参酮对酪氨酸酶的抑制作用机理。方法：采用紫外-可见分光光度法测定490nm处酪氨酸酶催化产生的多巴醌的吸光度，并通过Lineweaver-Burk双倒数作图法计算酪氨酸酶的Km和Vm值，考察丹参总酚酸、总丹参酮对酪氨酸酶的抑制作用及作用机理。结果：酪氨酸酶的Km=0.2067mg·ml-1，Vm= 0.0222·min-1，总丹参酮在浓度为2mg·ml-1抑制率为0.00%，丹参总酚酸浓度达到10mg·ml-1后Km变大，Vm变小。结论：总丹参酮对酪氨酸酶无抑制作用；丹参总酚酸对酪氨酸酶具有可逆抑制作用，抑制类型属于混合I型。

丹参；酪氨酸酶；总丹参酮；总丹酚酸；紫外-可见分光光度法

丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎，具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈的功效［1］。现代药理研究认为丹参具有保护皮肤，扩张血管、抗血栓形成、改善皮肤微循环、改善皮肤颜色、调节组织修复与抑菌等药理作用［2］，丹参所含的酚酸类成分如丹参素、原儿茶醛等具有抑制酪氨酸酶的活性。丹参的水溶性提取物丹参总酚酸具有独特宜人的天然清香气，是美容护肤用品的理想天然原料。

目前临床采用丹参注射液穴位注射配合中药汤剂治疗黄褐斑等色素沉积具有很好的疗效［3］。丹参在复方中使用同样具有良好的美白效果。将含有丹参的中药美白面膜通过超声波导入皮肤，治疗炎症引起的色素沉着，疗效达到90%［4］。美白验方祛斑方中含有丹参，张理梅等发现祛斑方能使黑色素阳性细胞数量明显下降［5］。

目前国内外的研究显示，丹参在化妆品中的应用前景良好。但是丹参对酪氨酸酶的抑制作用机理尚无研究。本文通过测定酪氨酸酶的米氏常数Km、最大反应速率Vmax，研究丹参总酚酸对酪氨酸酶的抑制作用机理。

1　仪器和材料

1.1仪器

Multiskan Mk3型酶标仪（赛默飞世尔仪器有限公司），LDZ4-0.8离心机（北京医用离心机厂），RE-52AA旋转蒸发仪（上海嘉鹏科技有限公司），DZKW-D-4型电热恒温水浴锅（上海树立仪器仪表有限公司），UV-5500型紫外-可见分光光度仪（上海元析仪器有限公司）。

1.2药品

酪氨酸酶（合肥博美生物科技有限责任公司，批号：34B14750），左旋多巴（合肥博美生物科技有限责任公司，批号：B150255），PBS缓冲溶液（自配，A液每1L含NaH2PO4·2H2O 7.80g，B液每1L含Na2HPO4·12H2O 17.80g），磷酸二氢钠，磷酸氢二钠为分析纯，水为超纯水，丹参药材（购自济南建联大药房，经山东中医药大学李保国副教授鉴定为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge）。

2　方法和结果

2.1丹参酮、丹参总酚酸制备

丹参加11倍量水，浸泡30min，80℃水浴回流提取2次，第一次提取2h，第二次提取1.5h，合并滤液，60℃减压浓缩至相对密度1.18～1.22，放冷，加乙醇使含醇量达到70%，4℃静置12h，虹吸上清液，减压回收乙醇，至稠膏状，干燥，即得丹参总酚酸提取物［1，6］。

丹参加8倍量90%乙醇，80℃回流提取2次，每次1h。滤过，合并滤液，60℃减压回收乙醇并浓缩至相对密度1.30～1.35，用热水洗至洗液无色，干燥，即得总丹参酮提取物［1，7］。

2.2供试液配制

2.2.1PBS缓冲液配制：精密称取磷酸二氢钠7.80g，用超纯水定容至1L，为A液。精密称取磷酸氢二钠17.80g，用超纯水定容至1L，为B液。121℃热压灭菌30min，使用时取等体积的A，B液体混合均匀，即得ph=6.8的PBS缓冲液。

2.2.2酶溶液配制：精密称取酪氨酸酶4.60mg，用PBS缓冲液定容至10ml，摇匀，精密移取400μl，用PBS定容至10ml，即得浓度为0.0184mg·ml-1的酶溶液。

2.2.3左旋多巴溶液配制：精密称取左旋多巴70.3mg，用PBS缓冲液定容至100ml，摇匀，超声10min，滤过，即得浓度为0.703mg·ml-1的左旋多巴溶液。

2.2.4丹参总酚酸溶液配制：取丹参总酚酸提取物约10g，精密称定，用PBS缓冲液定容至100ml，摇匀，超声10min，3 000r·min-1离心10min，取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得浓度为100mg·ml-1丹参总酚酸溶液。

2.3总丹参酮、丹参总酚酸对酪氨酸酶的抑制效果

取丹参总酚酸提取物约100mg，精密称定，用PBS缓冲溶液溶解，并定容至10ml。取总丹参酮提取物约20mg，精密称定，用1%吐温-80PBS缓冲液定容至10ml。用96孔板进行试验，试验方法见表1。

按表1加完试液后30℃反应10min，加入左旋多巴溶液200μl，30℃反应10min，用酶标仪测定吸光度，每组6个平行孔，求每组吸光度差值ΔA并计算平均值，数据以（x±s）表示，对结果进行t检验（双侧），用SPSS 17.0统计软件进行处理，并计算抑制率，抑制率公式为：抑制率=（1-加药组/空白组）×100%。结果见表2，丹参总酚酸组与空白对照组对比具有显著性差异（P＜0.05），总丹参酮组无显著性差异（P＞0.05），丹参总酚酸提取物对酪氨酸酶的的抑制率为28.57%，总丹参酮提取物对酪氨酸酶的抑制率为0.00%。

表1　分组及实验溶液加入方法

表2　总丹参酮、丹参总酚酸抑制酪氨酸酶实验结果

2.4丹参总酚酸对酪氨酸酶的抑制作用机理

2.4.1酪氨酸酶的Km和Vmax测定：分别精密移取左旋多巴溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0ml，用PBS缓冲液定容至10ml。A组为空白对照组，B组为实验组。A1到A10加入等体积不同浓度的左旋多巴溶液，B组按序号对应，加入与A组相同的左旋多巴溶液，按表3进行实验。30℃反应10min，用紫外-可见分光光度计测定490nm波长处的吸光度A。反应速度v=A/t，以底物浓度［S］为横坐标，以吸光度变化速率v为纵坐标，绘制v-［S］曲线，见图1，Km值在0.2mg·ml-1附近。

表3　酪氨酸酶的酶学常数测定方法

图1　v-［S］曲线图

根据酶学知识，底物浓度在0.3Km至2.0Km范围内为合理浓度。因此选择0.0703，0.1406，0.2109，0.2812，0.3515mg·ml-1的5组数据带入Lineweaver-Burk双倒数方程，得方程1/v=-9.311/［S］+45.045，（r= 0.9992），由方程可求出Km=0.2067，Vm=0.0222·min-1。

2.4.2丹参总酚酸对酪氨酸酶可逆抑制研究：根据酶学实验文献［8］，固定底物左旋多巴的量，改变酶量，测定不同浓度丹参总酚酸对酪氨酸酶催化速率的影响，在96孔板中加入酪氨酸酶溶液50，60，70，80，90μl，用PBS缓冲液补加至150μl。空白组设为A加100μl的PBS缓冲液，实验组设为B、C、D、E加100μl不同浓度丹参总酚酸溶液，30℃反应10min，然后加入100μl的左旋多巴溶液，30℃反应10min，立即测定吸光度值。不同酶浓度做3个平行孔，求均值。以吸光度变化速率为纵坐标，酶量为横坐标，进行线性回归，结果，随着丹参总酚酸浓度的增大，直线的斜率降低，见表4。

2.4.3可逆抑制作用类型考察：采用Lineweaver-Burk双倒数作图法来判断抑制作用类型［9］，固定加酶量，改变测定体系中底物左旋多巴量和丹参总酚酸的浓度。精密移取2.2.3项下左旋多巴溶液2、4、6ml，用PBS缓冲液定容至10ml。精密移取2.2.4项下丹参总酚酸溶液0.5、1.0、1.5、2.0ml，用PBS缓冲液定容至10ml。在96孔板上每孔加入50μl酪氨酸酶溶液，同列加入100μl相同浓度的丹参总酚酸溶液，且丹参总酚酸浓度由左向右递增，最左侧设置空白对照孔，加100μl的PBS缓冲溶液，30℃反应10min，所有孔均加入200μl的L-DOPA溶液，30℃反应10min，用酶标仪测定吸光度。用Lineweaver-Burk双倒数作图法，以1/［S］为横坐标，1/v为纵坐标，进行线性回归。线性方程见表5。

3　讨论

皮肤颜色不佳的确切原因及机制目前尚不清楚，一般认为其主要与内分泌失调、紫外线照射等因素有关。在正常生理状态下，皮肤内黑色素的生成和排泄呈动态平衡。暗黄的皮肤大多由于黑色素生成大于排泄，皮肤中黑色素的不断累积。酪氨酸酶是调控人体黑素色产生的关键酶，因此，美白的关键点是抑制酪氨酸酶的活性。改善肤色令皮肤焕发出自然光彩有两个着力点，一减少黑色素生成，二加快黑色素清除。丹参总酚酸能够抑制黑色素的生成；同时，丹参通过改善微循环可以加快黑色素清除。从两个方面帮助皮肤重新恢复动态平衡。

表5　不同浓度丹参总酚酸Lineweaver-Burk双倒数方程

在实验中随着丹参总酚酸浓度的增大，直线的斜率降低，如表4所示，说明丹参总酚酸对酪氨酸酶的抑制作用属于可逆过程。丹参总酚酸通过降低酪氨酸酶的催化效率而导致酶活力下降，不是减少有效酶量而引起酶活力下降。因此丹参美白基本不存在不可逆转的副作用，如有不适停止使用可恢复。

表4　丹参总酚酸浓度与线性方程关系表

丹参总酚酸浓度超过10mg·ml-1后，米氏常数Km变大，最大反应速度Vmax变小，如表5所示，因此抑制机理为混合I型。阐明抑制机理可以使丹参美白产品的制造和使用有据可依，也为丹参药妆的研究提供理论基础。

总丹参酮对酪氨酸酶没有抑制作用，而且对皮肤有很强的色素附着，难以洗除，因此，美白产品中不宜添加总丹参酮。

综上所述，丹参美白的有效部位是丹参总酚酸。因此，丹参作为美白化妆品原料时，应该使用水作为提取溶剂，这既有利于提取有效成分，也更加经济。这对于实际生产有一定的指导意义。

21世纪多学科交叉发展，使国际高端化妆品研究走向多层次、整体化。本文将医学、中药学、美容学相互融合提出了中药美白化妆品研制的新思路。医学与美容学结合，可以使美容学更安全，更完善。中药学与美容学结合，可以生产出功能性化妆品。本文研究丹参总酚酸对酪氨酸酶的抑制作用机理，从酶学层面阐释了丹参用于美白的可能性，为丹参美白护肤品的研制提供实验依据。不仅如此，在后续研究中还可以将本文中的方法作为一种快速、经济、灵敏的检测手段。

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Study on the inhibition of Salvia miltiorrhiza total phenolic acid on tyrosinase and their mechanism

SONG Ji-zheng，LI Ling-jun，SUN Peng，WANG Peng
（College of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，Shandong，China）

Objective To study the inhibition of Salvia miltiorrhiza total phenolic acid，Total tanshinone on tyrosinase and their mechanism.Methods Using ultraviolet-visible spectrophotometry determines the absorbance of tyrosine enzyme catalysis to produce Dopaquinone at 490nm and calculates the Km，Vmvalues of tyrosinase through the method of Lineweaver-Burk Plot；Studying the inhibition of Salvia miltiorrhiza total phenolic acid，Total tanshinone on tyrosinase and their mechanism.Results Tyrosinase Km=0.2067mg·ml-1，Vm=0.0222·min-1，when the concentration of Total tanshinone reaching 2mg·ml-1，the inhibition rate was 0.00%；when the concentration of Salvia miltiorrhiza total phenolic acids reaching 10mg·ml-1；the higher Kmbecome，the lower Vmbecome.Conclusion Total tanshinone had no effects on tyrosinase，the inhibition of Salvia miltiorrhiza total phenolic acid on tyrosinase was reversible，the Inhibit type belongs to mixed type I.

Salvia miltiorrhiza；tyrosinase；total tanshinone；Salvia miltiorrhiza total phenolic；Ultravioletvisible spectrophotometry

Q591 R758.4+2

A

1008-6455（2015）22-0025-04

2015-08-10

2015-10-23

编辑/张惠娟

李凌军，男，博士，副教授，研究方向：中药新制剂与新技术；E-mail：lljun66@163.com