基于VP1基因的小鹅瘟病毒PCR快速检测方法的建立和应用

于新友+李天芝+沈志强

摘要：根据GenBank公布的小鹅瘟病毒VP1基因保守序列设计了一对引物，建立了检测小鹅瘟病毒PCR方法，并对其特异性、敏感性进行了研究。该PCR方法对小鹅瘟病毒扩增结果为阳性，对照毒株扩增结果均为阴性;对小鹅瘟病毒检测的灵敏性为1pg总DNA量。以上结果表明，该PCR方法特异性强、敏感性高、简便、快速，可用于小鹅瘟的早期确诊和病毒鉴定。

关键词：小鹅瘟病毒;PCR;检测

中图分类号：Q789      文献标识码：B      文章编号：1673-1085（2015）03-0031-04

小鹅瘟（Gosling plague，GP）是由小鹅瘟病毒（Gosling plague virus，GPV）所引起的雏鹅的一种急性或亚急性败血性传染病。病鹅临床表现为下痢、腿瘫痪、精神萎靡、食欲废绝，主要病理学特征为小肠中后段黏膜坏死、脱落，有纤维素性渗出物凝固形成腊肠状栓子[1]。该病主要危害3～20日龄小鹅，特别是10日龄之内的雏鹅更易感染，发病率和死亡率高达100%，且传播速度快，是对养鹅业产生严重危害的一种重要传染病[2]。1956年我国科研工作者首先报道了小鹅瘟这种疾病[3]，此后世界上许多国家都有该病的报道。目前，GPV诊断方法有病毒的分离和鉴定、酶联免疫吸附试验[4]、反向间接血凝试验[5]、免疫酶琼脂扩散试验[6]和PCR方法[7]等，但是上述方法均存在不同的缺点，或检测灵敏度低，或检测时间长，或操作复杂。近年来，发展PCR检测方法具有检测速度快、特异性好、灵敏度高等优点，已经广泛应用于动物疾病的检测。笔者通过不断优化反应条件，建立了检测小鹅瘟病毒PCR方法，为小鹅瘟的临床诊断和流行病学调查提供了一种简便、快速、有效的方法。

1  材料和方法

1.1  病毒株与病料  小鹅瘟病毒、鹅副粘病毒、鹅病毒性肝炎病毒、鹅源鸭瘟病毒、鹅圆环病毒、鹅H9亚型禽流感病毒和鹅呼肠孤病毒由本实验室保存，临床检测病料为2014年采自山东省各地小鹅场临床诊断为GPV感染的小鹅的肝脏、脾脏等。

1.2  工具酶及试剂盒  pMD18-T载体、Premix Tag、DL2000 MarKer购自大连宝生物公司，AxyPrep体液病毒DNA小量试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司，DNA凝胶回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3  PCR引物设计与合成  根据GenBank中登录的GPV基因序列（AY382889），应用Primer Premier5.0软件，设计1对特异性引物，扩增GPV的VP1基因507bp部分片段。引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物：5′-ATGTGAGAAAGCAAACTT-3′，下游引物：5′-CTATCTATAAAGTCCTGG-3′。

1.4  GPV基因组DNA的提取  按AxyPrep体液病毒DNA小量试剂盒使用说明书提取GPV的DNA，并提取其它几种病毒的核酸。

1.5  GPV VP1基因的PCR反应条件的确立  以提取的GPV DNA作为模板，进行PCR反应，扩增VP1基因。在其它条件不变的情况下，对反应的退火温度进行优化，分别采用42℃、44℃、46℃、48℃、50℃、52℃等6种不同的退火温度进行扩增;在其它条件不变的情况下，对反应的引物浓度进行优化，分别采用0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.6μmol/L、0.8μmol/L、1.0μmol/L、1.2μmol/L等6种不同引物浓度进行扩增。反应体系保持为25μl，PCR反应的条件保持不变，为95℃预变性5min，95℃ 30S、46℃ 30S，72℃ 30S ，共30个循环，最后72℃延伸10min。

1.6  PCR扩增产物的检测及鉴定  取5μl PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，紫外灯下观察扩增结果。如果有目的条带，则切下目的条带，按照DNA凝胶回收试剂盒的说明书操作，回收目的片段VP1。将回收后的VP1与pMD18-T连接。将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，37℃过夜培养后，挑取单菌落摇菌过夜，按质粒提取试剂盒的说明书抽提培养菌液的质粒，用建立的PCR方法检测质粒是否含有VP1基因。如果含有VP1基因，将提取的质粒发送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测序结果与参照的GPV基因序列进行基因相似性分析。

1.7  特异性试验  分别提取小鹅瘟病毒、鹅副粘病毒、鹅病毒性肝炎病毒、鹅源鸭瘟病毒、鹅圆环病毒、鹅H9亚型禽流感病毒和鹅呼肠孤病毒等7种不同的病毒核酸作为模板，用已建立的PCR检测方法进行扩增。

1.8  敏感性试验  提取GPV基因组DNA，用仪器测定含量，然后10倍系列稀释，使GPV基因组DNA的含量分别为10ng DNA、1ng DNA、100pg DNA、10pg DNA、1pg DNA、0.1pg DNA。分别将其作为模板，用建立的方法分别进行PCR检测扩增，确定PCR检测方法的敏感性。

1.9  重复性试验  为了验证所建立PCR检测方法的重复性，分别提取3批小鹅瘟阳性病料、阴性病料以及6种阴性对照病毒如鹅副粘病毒、鹅病毒性肝炎病毒、鹅源鸭瘟病毒、鹅圆环病毒、鹅H9亚型禽流感病毒和鹅呼肠孤病毒的核酸作为模板，进行PCR扩增反应。

1.10  临床样品的检测  提取临床上送检的25份GP疑似病料的基因组DNA作为模板，用建立的PCR检测方法扩增检测，并用生物学软件分析扩增产物的序列。endprint

2  结果

2.1  扩增产物的检测  用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果在507bp出现目的DNA条带，见图1，和预期大小一致（预期大小为507bp）。

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2.2  特异性试验  利用所设计的引物及所确定的最佳反应条件分别对小鹅瘟病毒、鹅副粘病毒、鹅病毒性肝炎病毒、鹅源鸭瘟病毒、鹅圆环病毒、鹅H9亚型禽流感病毒和鹅呼肠孤病毒进行PCR扩增。结果7个毒株中只有小鹅瘟病毒能扩增出相应的片段，大小为507bp（预期507bp），而其它均未扩增出相应的片段，见图2。说明本研究建立的方法特异性好。

2.3  敏感性试验  用1.5%琼脂糖凝胶电泳分别检测5μLPCR扩增产物，5份样品产物在507bp位置均有目的条带，与预期一致;1份样品产物无扩增条带。结果显示，引物的检测灵敏度可达1pg DNA，见图3。

2.4  重复性试验  重复性试验结果显示，3批不同的病料的检测结果相同，说明建立的PCR检测方法重复性好、可靠、稳定。

2.5  扩增产物测序  测序结果如下：                                         ATGTGAGAAAGCAAACTTTCCTGAATTTCAACCTCTGGGAGAAAATTATTGTGATGAACATGGGTGGTATGATTGTGCTATATGTAAAGAGTTGAAAAATGAACTTGCAGAAATTGAGCATGTGTTTGAACTTGATGATGCTGAAAATGAACAATAAAGATGACTCAAAGCAGATATGTCTACTTTTTTAGATTCTTTTGAAGAGTGGTATGAAACTGCAGCCGCCTCGTGGCGGAATCTGAAAGCTGGAGCCCCTCACCCAAAACCAAACCAGCAGACTCAGTCTGTGTCTCCAGCCAGAGAACCCGAACGAAGAGATAATAACCGGGGCTTTGTACTTCCTGGCTATAAGTATCTTGGCCCTGGTAACGGCCTTGATAAAGGGCCACCCGTTAATAAGGCGGACAGCGTCGCGCTTGAACACGACAAGGCCTACGACCAACAGCTTAAAGCGGGAGACAACCCATATATAAAATTCAATCACGCTGACCAGGACTTTATAGATA

将测序结果与参照的GPV基因序列进行基因相似性分析，其同源性为100%。

2.6  临床样品的检测  用建立的方法检测的25份GP病料中，有7份结果呈阳性。

3  讨论

邵洪泽等[8]根据小鹅瘟病毒VP3基因设计合成一对引物，建立了用于检测小鹅瘟病毒的PCR方法。该法每 5μl样品中获得阳性扩增结果中最小检出量为2.5×10-1.58ELD50小鹅瘟病毒量。本试验对GenBank公布的GPV基因序列进行比对，发现GPV VP1基因相对比较保守，查找出其高度保守区域，参照GenBank中登录的GPV基因序列（AY382889），利用Primer Premier5.0设计1对引物，通过PCR扩增出目的基因，连接到pMD18-T载体，送样测序，对测序结果与模板序列进行比对，其同源性为100%。对退火温度优化，发现只有当退火温度值为46℃时，才能获得较为理想的产物，即使相差2℃也不能获得理想的试验结果。对引物浓度进行优化，在引物浓度为0.2～1.2μmol/L时不影响PCR反应的扩增效率，扩增效率相对较高的引物浓度为0.6μmol/L，增效率相对较低的引物浓度为1.2μmol/L。敏感性试验结果显示，引物的检测灵敏度可以达到1pg DNA。本试验所建立的GPV PCR检测方法能够扩增出507bp目的片段，而对常见的小鹅病病毒：如小鹅细小病毒、小鹅圆环病毒、鹅源鸭瘟病毒、小鹅肝炎病毒、小鹅H9亚型禽流感病毒和小鹅副粘病毒均无扩增产物，证明本方法具有很好的特异性。用建立的GPV PCR检测方法，检测20份小鹅瘟病料，检出7份阳性病料，因此，本试验所建立的方法为GP的流行病学调查和检测提供了一种简单、快速和有效的方法。

参考文献：

[1]  Calnek B W.禽病学[M].10版.高福，苏敬良，译.北京：中国农业大学出版社，1999：988-995.

[2]  盘磊，李福伟，李惠敏.小鹅瘟的生物学特性研究概况[J].水禽世界，2007（2）：49-52.

[3]  殷震，刘景华.动物病毒学[M].2版.北京：科学出版社，1997：165-168.

[4]  李新华.应用斑点酶免疫吸附试验快速诊断小鹅瘟[J].中国兽医科技，1998，28（1）：13-18.

[5]  徐为燕，周阳生.小鹅瘟病毒反向间接血球凝集实验的初步报告[J].畜牧兽医学报，1981，12（1）：23.

[6]  秦爱建.免疫鹅琼脂扩散实验在小鹅瘟诊断中的应用[J].中国预防兽医学报，1993，15（1）：30-31.

[7]  胡桂学，逄博，高凤山，等.小鹅瘟PCR诊断方法的建立和初步应用[J].经济动物学报，2003，7（2）：50-53.

[8]  邵洪泽，李琳，毛文智，等.鹅细小病毒PCR检测方法的建立及应用[J].吉林畜牧兽医，2009，5（30）5-9.endprint