慢性温和应激后老年大鼠抑郁症状及HSP70的变化

钟静玫 郭 强 陈 辉 赵乃伟 赵 忠 (云南省第一人民医院临床心理科，云南 昆明 650032)

抑郁症是常见多发病，而老年期的抑郁症发病率尤高，达到36.8%〔1〕。抑郁症发病机制目前尚未完全清楚，目前有观点认为心理应激与抑郁易损基因的相互作用，导致的氧化应激、神经细胞凋亡、神经可塑性改变与抑郁症有关〔2〕。老年期存在应激应答能力、抗氧化、抗凋亡能力及神经重塑能力的改变〔3〕。而热休克蛋白70(HSP70)是一种应激应答蛋白，具有抗氧化、抗凋亡，增加神经元可塑性的作用〔2〕。本研究旨在了解老年大鼠在慢性温和应激的作用下，HSP70水平的改变及其对抑郁症状的影响。

1 资料与方法

1.1 动物与分组 老年期大鼠为SPF16月鼠龄SD雄性大鼠12只，体重460～575 g，按体重随机分为两组，各6只一组接受Western印迹和RT-PCR检测，另一组接受免疫组化检测;对照组为SPF标准3月鼠龄的SD雄性大鼠12只，体重180～220 g，按体重随机分为两组，各6织一组接受Western印迹和RT-PCR检测，另一组接受免疫组化检测。大鼠购自四川省简阳达硕动物科技有限公司，动物合格证号0023237，许可证号:SCXKL 11122008-74。适应性喂养1 w，鼠舍温度(21±1)℃，湿度40% ～60%，12 h光照与黑暗循环，早8点亮灯，20点熄灯，能够自由地接近食物与水，一鼠一笼。适应性喂养第4、5天，给予每笼1%蔗糖水。第6、7天，给予每笼1%蔗糖水和纯净水各一瓶。第8天开始进行慢性温和应激，应激前后分别进行抑郁症状行为学检测。行为学检测完成后，将大鼠用无巴比妥(60 mg/kg)麻醉。对进行Western印迹、RT-PCR检测的大鼠断颈取脑，分别取出大鼠海马与额叶，经液氮固定后放置于－80℃冰箱冻存备用。对进行免疫组化的大鼠，采用4%的多聚甲醛内固定，剥取全脑后用4%的多聚甲醛外固定。外固定后48 h，经梯度脱水，石蜡包埋，行冠状切片，片厚5 μm。

1.2 抑郁症状行为学检测 ①糖水偏好实验:第8天8点开始禁饮禁食24 h，次日8点每笼给予1%蔗糖水和纯净水各一瓶，喂养1 h。喂养前后分别将1%蔗糖水和纯净水称重，前后水量的差值为消耗量，计算出1%蔗糖水在总消耗量中的百分比，为糖水偏好程度。于3 w慢性温和应激的最后1 d 8点禁饮禁食24 h，次日8点再次进行糖水偏好实验，检测糖水偏好程度。首次糖水偏好程度减去末次糖水偏好程度，为糖水偏好程度下降值。②敞箱实验:糖水偏好实验后进行敞箱实验。将每只大鼠放入敞箱中央格，开始计时2 min，分别计数垂直运动指数、水平运动指数、中央格停留时间。垂直运动指数为前腿抬离地面的次数;水平运动指数为四肢离开1个正方形小格的次数;中央格停留时间为从计时到四肢离开中央格的时间。

1.3 慢性温和应激 慢性温和应激的内容包括:禁饮禁食24 h(8∶00 ～ 次日 8∶00)，限制 1 h(8∶00 ～9∶00)，旋转鼠笼30 min(8∶00 ～8∶30)，鼠笼倾斜12 h(8∶00 ～20∶00)，同性入侵24 h(8∶00 ～ 次日8∶00)，湿笼12 h(8∶00 ～20∶00)，昼颠倒12 h(8∶00 ～20∶00)，夜颠倒12 h(20∶00 ～8∶00)。每周随机安排每天的慢性温和应激内容，持续3 w。

1.4 Western印迹 首先进行蛋白的提取，将少量组织块置于匀浆器中，加400 μl单去污剂裂解液裂(含 PMSF)于匀浆器中，重复碾压组织尽量碾碎，裂解30 min后将裂解液移至1.5 ml离心管中，然后在4℃下12000 r/min离心5 min，取上清分装于0.5 ml离心管中并置于－20℃保存。然后进行蛋白定量。随后进行SDS-PAGE电泳，配10%分离胶，加入 TEMED后立即摇匀即可灌胶;配4%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶;计算含20 μg蛋白的溶液体积即为上样量;取出上样样品至200 μl的EP管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1倍。将样品置于热变性装置中5 min使蛋白变性;加足够的电泳液后开始上样;电泳45 min。转膜至PVDF膜上75 min。10%脱脂奶封膜，4℃过夜。TPBS洗膜，标一抗，抗HSP70单克隆抗体及抗β-actin(Cruz Co.)。TPBS洗膜，标二抗。再洗膜，最后化学发光，显影，定影。以HSP70与β-actin条带光密度的比值表示HSP70蛋白的相对水平。

1.5 RT-PCR 将组织剪碎，液氮研磨后，Trizol法提取总RNA，并经完整浓度、纯度测定，符合实验室要求。根据Gen-Bank中HSP70与β-actin mRNA序列设计特异性引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。HSP70正义引物为5＇-GCTGGTGAGCCACTTCGTG-3＇，反义引物为 5 ＇-TGGATCTGCGCCTTGTCC-3＇，扩增产物为288 bp。β-actin 正义引物为5＇-CACTGCCGCATCCTCTTCCTC-3 ＇，反 义 引 物 为 5 ＇-CTCCTGCTTGCTGATCCACAT-3＇，β-actin PCR扩增产物为400 bp。PCR反应体系为:5 μl cDNA，14.5 μl 2 × Taq PCR MasterMix，3.5 μl H2O，上下游引物各1 μl。HSP70反应条件:94℃预变性2 min;94℃3min;56℃ 30 s，72℃ 45 s，29 个循环;72℃延伸10 min。β-actin反应条件:94℃预变性5 min;94℃ 30 S;59℃ 1 min，72℃ 1 min，28个循环;72℃延伸10 min。PCR产物由2%的琼脂糖凝胶进行电泳，以 HSP70与 β-actin条带光密度的比值表示HSP70 mRNA的相对表达量。

1.6 免疫组化 石蜡切片常规脱蜡;微波抗原修复20 min;滴加山羊血清，室温下15 min;滴加兔抗鼠HSP70单克隆抗体(浓度1∶100，Santa Cruz Co.)，4℃过夜;以非免疫血清代替一抗作为阴性对照，用DAKO公司的EnVisionTM法检测12例组织标本，按说明操作，DAB显色。免疫组化结果判断:以细胞质(或细胞核/细胞膜，根据每个抗体不同)中出现棕黄色颗粒为染色阳性，分别在至少有5个代表性的高倍视野计数500个细胞中的阳性细胞数。染色结果综合染色强度及阳性细胞数量两个方面进行半定量分析，分别评分。染色强度:阴性(0分)，浅黄色(1分)，棕黄色(2分)，棕褐色3分;阳性细胞数计分:无着色细胞为0分，阳性细胞数占5% ～25%为1分，26% ～50%为2分，51% ～75%为3分，76%以上为4分。根据两项结果相加分数判断结果:0～1分(－)，2～3分(+)，4～5分()，6～7分()。

1.7 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行t及χ2检验。

2 结果

2.1 慢性温和应激前后行为学检测 老年组大鼠糖水偏好程度的下降明显大于青年组;老年组垂直运动指数、水平运动指数、中央格停留时间均低于青年组(P＜0.05)。见表1。

表1 慢性温和应激前后行为学指标比较(±s，n=6)

表1 慢性温和应激前后行为学指标比较(±s，n=6)

组别 糖水偏好试验(%)垂直运动指数(次)水平运动指数(次)中央格停留时间(s)39.40±15.824.50±1.5223.3±12.328.30±6.97青年组 17.17±14.231.17±3.259.50±7.041.47±1.45 t值 2.5590 2.2734 2.3650 2.3500 P值老年组0.0284 0.0463 0.0396 0.040

2.2 Western印迹检测 HSP70 在海马与额叶，老年组的HSP70水平也明显低于青年组(P＜0.05)，见表2，图1。

表2 Western印迹检测HSP70表达结果比较(±s，n=6)

表2 Western印迹检测HSP70表达结果比较(±s，n=6)

组别 海马组 额叶组老年组0.75±0.080.51±0.08青年组 0.89±0.060.72±0.16 t/P值3.4293/0.0064 2.8755/0.0165

图1 两组间HSP70的Western印迹检测对比

2.3 RT-PCR检测HSP70 mRNA表达 在海马与额叶，老年组的HSP70水平也明显低于青年组(P＜0.05)。见表3，图2。

2.4 免疫组化检测HSP70蛋白表达 在海马与额叶，HSP70染色呈+及以下的，老年组明显高于青年组，而及以上的，老年组明显低于青年组(P＜0.05)。见表4，图3。

表3 HSP70 RT-PCR结果比较(±s，n=6)

表3 HSP70 RT-PCR结果比较(±s，n=6)

组别 海马组 额叶组老年组0.93±0.020.88±0.08青年组 1.05±0.051.08±0.09 t/P值5.4583/0.0003 4.0684/0.0023

图2 HSP70 mRNA RT-PCR结果比较

表4 免疫组化检测HSP70蛋白表达比较(n=6，n)

图3 免疫组化法检测HSP70蛋白表达(DAB，×10)

3 讨论

抑郁症通常表现为以情绪低落为核心症状，并表现出兴趣低下，活动减少，饮食睡眠等改变，可伴有植物神经症状，持续2 w以上，反复发作的精神疾病由于本病对工作、生活、人际关系有明显的影响，甚至会导致绝望、自杀，危害严重〔4〕。本研究借助慢性温和应激来构建鼠的抑郁症模型〔5〕。通过随后的糖水偏好实验、敞箱实验、强迫游泳实验对鼠的抑郁症状进行观察、评价、量化、记录。动物在实验中表现出来的糖水偏好减少，运动减少，甚至不动，分别与抑郁中的兴趣低下，活动减少，绝望等症状相对应。一系列研究显示抑郁症中也存在氧化应激、神经细胞凋亡、神经可塑性改变等病理生理过程〔2〕。老年期的抑郁症发病率高达到36.8%〔1〕，这可能与老年期应激应答能力、抗氧化、抗凋亡能力以及神经重塑能力衰退有关〔3〕。而HSP70作为抗氧化、抗凋亡的蛋白，且参与脑源性神经生长因子(BDNF)介导的神经营养作用〔2〕，与抑郁症和老年期脑改变均有关联，所以本研究的目的就是要了解慢性温和应激中HSP70的反应能力，是否会因为老龄而下降。本研究说明老年期大鼠在应激状态下更容易出现抑郁症状，而且HSP70在老年期的脑组织中反应能力也降低。虽然HSP70是应激状态下多种细胞内都会产生的，对细胞产生保护作用的蛋白质家族成员之一，它可以与伴侣蛋白质51 kD FK506结合蛋白协作，负反馈调节糖皮质激素受体(GR)活性〔6〕;也可以通过抑制一氧化氮合酶(NOS)和活性氧(ROS)的活性，而产生抗氧化〔7〕;还可通过与凋亡信号调节激酶(ASK1)结合，阻碍 JNK1活性，稳定PKC和Akt，而抑制caspase-3凋亡等多条途径产生抗凋亡的作用〔8〕;而且提高 HSP70的许多物质，如多酚类、原花青素、HDAC抑制剂等，均可提高BDNF水平，有增加神经元的可塑性的作用〔9〕。但是老年期大鼠的研究显示，老年期大鼠海马在无应激刺激的状态下，也存在着应激时才应该出现的皮质酮(CORT)水平增高及星形胶质细胞反应，而且老年期大鼠应激后CORT水平恢复的时间要比正常对照恢复的时间延长〔10〕。老年期大鼠的CORT结合蛋白(CBGs)水降低，糖皮质激素受体兴奋性高，更容易激活Bcl-2，导致凋亡〔11〕。另外老年期的BDNF以及其受体的水平都有一定程度的下降，从而会影响神经的重塑能力〔12〕。这些因素不光会导致老年期抑郁症状更容易出现，还与HSP70降低有关。老年的这种类似应激的持续状态，会导致细胞核与细胞质中的 HSP70水平下降〔13〕，这与HSP70在蛋白水平与RNA水平均降低的表现一致。

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