沉默NGAL基因对肺癌细胞迁移及侵袭的影响

唐健 李捷 李少军 李璟波 于长海 尉承泽

肺癌，又称原发性支气管肺癌，是肺部常见的恶性肿瘤。在全球，肺癌的发病率和死亡率均居癌症之首，而且目前呈现出一种继续上升趋势[1]。NGAL基因的蛋白编码产物是一种25 kDa的糖蛋白，是1993年由Kjeldsen等[2]在中性粒细胞中首先发现，是脂质运载蛋白（Lipocalln）家族的成员之一。肿瘤组织中，如肺癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌和胰腺癌等，均能够检测到NGAL基因高表达[3]。这提示NGAL可能与肿瘤的发生和发展有关[3-6]。本研究旨在探讨NGAL在肺癌组织的表达，观察小干扰RNA（siRNA）沉默NGAL基因表达对肺癌细胞增殖及侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选择解放军总医院第一附属医院胸外科76例肺癌患者手术切除的肺癌及30例癌旁组织蜡块（2010年5月-2014年4月），所有标本均经多聚甲醛固定，石蜡包埋，5 μm厚连续切片。年龄45岁-72岁，平均年龄62.6岁。

1.2 试剂 高转移的肺癌细胞系A549购自中国科学院，培养基RPMI-1640购自Gbico公司，siRNA oligos购自上海吉玛公司，转染试剂X-tremeGENE（Roche公司），鼠一抗NGAL、GAPDH、MMP-2、MMP-9抗体，兔一抗E-cadherin、Vimentin购自Santa Cruz公司；Alex 594/488标记羊抗兔二抗（Jackson公司），HRP标记的二抗羊抗兔、HRP标记的羊抗鼠（北京中杉金桥公司），TRIzol（Invitrogen公司），反转录试剂盒及定量PCR试剂盒（TAKARA公司）；倒置荧光显微镜为Zessis公司、移液器均为Eppendorf公司。免疫组化SP法试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 A549细胞用RPMI-1640培养液，含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素的培养液，置37 ℃，5%CO2条件下培养。

1.3.2 免疫组织化学 60 ℃烤片20 min后，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；3% H2O2室温孵育15 min，PBS冲洗3次（每次不少于5 min）；抗原修复后以羊血清工作液封闭，室温孵育30 min加一抗于4 ℃过夜，用与一抗相应的免疫血清IgG代替一抗作为阴性对照； 滴加生物素标记二抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗后滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液；二氨基联苯胺（DAB）显色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。

1.3.3 免疫荧光 石蜡切片脱蜡，水化5 min后，蒸馏水洗3次，3 min/次；微波抗原修复10 min，冷却至室温；滴加正常山羊血清，室温孵育1 h，封闭抗原非特异性结合位点。滴加一抗兔抗Cadherin（1:1,000），Vimentin（1:1,000）（Santa Cruz公司）4 ℃孵育过夜。PBS洗3次，5 min/次；滴加Alex594/488标记的羊抗兔IgG（1:1,000）二抗，室温孵育1 h。PBS洗3次，5 min/次；滴加DAPI，孵育10 min，用来染细胞核；PBS洗3次，3 min/次；抗荧光淬灭封片剂封片。用与一抗相应的免疫血清IgG代替一抗作为阴性对照。用Zessis荧光显微镜拍照。

1.3.4 转染 按Invitrogen公司提供的脂质体LipofectamineTM2000转染程序进行。将各组siRNA与转染试剂混合物加入各个培养细胞的六孔板，转染24 h后，更换正常培养液进行实验。NGAL干扰序列为5′-ACATCCGGCAGGACAATGA-3′；对照序列为5′-AACGUACGCGGAAUACUUCGA-3′[7]。

1.3.5 qRT-PCR检测A549细胞中NGAL mRNA的表达 分别收集对数生长期的转染及对照组A549细胞，按TRIzol试剂盒说明书提取细胞总RNA，用紫外分光光度计分别测定RNA浓度，根据吸光度（optical delnsity,OD）260和OD280的比值，判定其纯度。分别取5 μg细胞总RNA，按反转录试剂盒说明书反转录成cDNA，以cDNA 为模板应用。反应条件为：94 ℃预热3 min，然后94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，扩增29个循环，72 ℃延伸10 min。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，通过ImageJ图像分析软件分析各电泳条带的灰度值，以目的条带的灰度值与GAPDH内参照条带的灰度值的比值表示各目的基因mRNA的相对表达量。NGAL的上游引物为5′-GAAGACAAAGACCCGCAAAAG-3′，下游引物为5′-CTGGCAACCTGGAACAAAAG-3′。内参GAPDH的上游引物为5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物为5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.3.6 蛋白质印迹检测NGAL蛋白的表达 转染24 h后，A549细胞中加入适量RAPI（PMSF）裂解液，碾碎匀浆，离心提取总蛋白，按照BCA法测定总蛋白浓度，上样量为每孔30 μg总蛋白。按1:4加上样缓冲液后，98 ℃变性10 min。100 V恒压电泳，电泳后进行湿式电转。转膜后用5%牛奶封闭液封闭1 h，一抗鼠来源的NGAL、MMP-2、MMP-9、GAPDH，兔来源的E-cadherin、Vimentin用0.05%TBST按1:1,000稀释，4 ℃孵育过夜，0.05%TBST洗3次，每次5 min。二抗为HRP标记的羊抗兔IgG，羊抗鼠IgG（1:1,000），室温孵育1 h，0.05%TBST洗3次，每次5 min。用ECL化学发光法来检测，试验重复3次。

1.3.7 MTT检测A549细胞球的生长抑制率 转染24 h后，取生长良好的A549细胞球消化成细胞悬液，计数并将细胞浓度调整到1×103/孔，接种于96孔板。培养24 h、48 h后，每孔加入10 μL（5 mg/mL）的MTT溶液，孵育4 h后，每孔加入100 μL Formanzan溶液，继续孵育直至显微镜下观察到Formanzan全部溶解。用酶标仪在570 nm处检测各孔OD，空白孔调零。细胞存活率=实验孔/对照孔×100%；细胞生长抑制率=（1-实验组OD值/空白对照组OD值）×100%。

1.3.8 细胞侵袭及迁移实验 用无血清RPMI-1640培养液按1:5稀释Matrigel胶，加人80 μL于Transwell板上室，将Transwell小室置于24孔板中，37 ℃孵育5 h待胶凝固。转染24 h后，将细胞用0.25%胰酶消化，用无血清培养基悬浮并计数。转染NGAL-SiRNA及对照组A549细胞各取200 μL（5×105个/mL）加入上室，加入滤膜直径为8 μm的Transwell小室中。下室加600 μL含有10%FBS的RPMI-1640培养液，细胞继续培养12 h。取出Tanswell上室，PBS洗涤2次，用棉签擦去上表面的细胞，加无水甲醇固定细胞30 min；用0.4%的结晶紫染色液染色2 h。在光学显微镜（×100）下计数穿过基膜的细胞数，每张膜随机选取10个视野，每组设3个重复样品。侵袭率=（实验组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数）×100%。迁移实验只是在Transwell上室不加Matrigel胶，迁移率=（实验组迁移细胞数/对照组迁移细胞数）×100%。

1.3.9 细胞划痕 在24孔板中加入约5×105个细胞，培养24 h后用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕。用PBS洗细胞3次，加入完全培养基，37 ℃、5%CO2条件下再培养24 h后取样，拍照。实验至少重复3次，取平均值。

1.3.10 统计学方法 采用SPSS 11.0统计软件，数据比较采用t检验。Western blot条带灰密度用ImageJ软件进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化检测NGAL蛋白在肺癌组织中的表达 通过免疫组化检测NGAL在肺癌中的表达，结果发现NGAL在癌旁组织中表达率为13.3%（4/30），而在肺癌组织中NGAL的阳性信号主要定位于胞质（图1），其阳性表达率为76.32%（58/76），明显高于癌旁组织中NGAL的表达水平（P＜0.01），提示NGAL与肺癌的发生发展有关系。

2.2 干扰NGAL的效率 A549细胞转染NGAL-siRNA 24 h后，用qRT-PCR和Western blot检测干扰NGAL的效果，发现control-siRNA转染组NGAL mRNA的表达量为1.05±0.09，NGAL-siRNA转染组NGAL mRNA的表达为的0.35±0.08，明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01，图2A）。与NGAL mRNA表达相一致，NGAL-siRNA转染组NGAL的蛋白表达量较对照组的表达量降低（图2B）。结果提示，NGAL特异性SiRNA从转录和翻译水平高效抑制NGAL表达。

2.3 干扰NGAL抑制A549细胞的增殖 转染后，分别培养24 h、48 h后，用MTT法检测细胞增殖情况，结果发现沉默NGAL后，A549细胞增殖能力与对照组相比，受到明显的抑制。24 h、48 h细胞存活率为64.92%、56.58%；抑制率分别为35.08%、43.42%，与对照组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

2.4 干扰NGAL表达抑制A549 细胞的体外迁移和侵袭 应用Transwell小室迁移实验发现在接种细胞24 h后，A549细胞穿过8 μm孔径膜的细胞数，对照组为每视野248.0±16.1，而NGAL-SiRNA组穿过膜的细胞数为每视野190.7±14.6（P＜0.05）。Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力，在接种细胞24 h后，A549细胞穿过Matrigel胶的细胞数，对照组为每视野152.3±11.4，而NGAL-SiRNA实验组穿过Matrigel胶侵袭的细胞数为74.3±11.9（P＜0.01）。细胞划痕实验显示，干扰组的细胞迁移较对照组和空质粒组缓慢，划痕后24 h，对照组细胞迁移明显，而干扰组迁移不明显。A549细胞对照组细胞迁移率为81.05%±4.36%，干扰组为41.33%±5.56%，差异有统计学意义（P＜0.05）（图4）。以上结果表明下调NGAL基因的表达后，A549细胞的迁移及侵袭能力明显被抑制。

2.5 干扰NGAL抑制上皮细胞-间质细胞转化（epithelialmesenchymal transition, EMT）相关蛋白E-cadherin和Vimenntin的表达，同时也抑制MMP蛋白的表达 转染后再培养24 h，用免疫荧光及Western blot检测细胞EMT相关蛋白E-cadherin、Vimentin的表达情况。免疫荧光结果显示，干扰NGAL后E-cadherin表达的荧光强度明显强于对照组；而Vimentin的表达强度低于对照组（图5A）。Western blot检测显示，干扰NGAL后A549细胞中E-cadherin蛋白的表达水平明显于高于对照组，为对照组的2.27倍；Vimentin的表达较对照组明显降低，为对照组的0.23倍，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图5）。干扰NGAL后，用Western blot检测了A549细胞中MMP-2和MMP-9的表达，发现确实能够抑制MMP-2和MMP-9蛋白的表达，分别为对照组的0.37倍和0.26倍，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，近年来其发病率在我国呈上升和年轻化趋势，其发生、发展和转移均涉及极其复杂的多基因调控异常过程[1]。因此，研究肺癌的病因、发病机制具有重要的临床意义。

图 1 免疫组织化学检测NGAL在癌旁组织（A）及肺癌（B）组织中的表达（×400）Fig 1 The expression of NGAL in adjacent mucosa (A) and lung cancer (B) was detected by immunochemistry (×400)

图 2 实时荧光定量PCR及Western blot检测干扰NGAL的表达情况。A：qRT-PCR检测表明NGAL mRNA在NGAL-siRNA转染的A549细胞中的表达明显下调；B：Westem blot检测表明NGAL蛋白在NGAL-siRNA转染的A549细胞中表达水平明显下调。Fig 2 The expression of NGAL mRNA and protein treated with NGAL-SiRNA. A: NGAL mRNA was down-regulated treated with NGAL-SiRNA in A549 cells by qRT-PCR; B: NGAL protein was down-regulated treated with NGAL-SiRNA in A549 cells by Western blot.

图 3 干扰NGAL后细胞在24 h、48 h的增殖情况。与对照组比较，*P＜0.05，#P＜0.01。Fig 3 NGAL downregulation reduced cell proliferation treated with NGAL-SiRNA after 24 and 48 h. Compared with control group, *P＜0.05, #P＜0.01.

NGAL是由Kjeldsen等[2]在1993年在人中性粒细胞中发现的。NGAL是Lipocalin家族成员之一。NGAL是分子量为25 kDa的多肽链，含有178个氨基酸残基，定位于人染色体9q34上，全长5,869 bp。近年来，一些研究提示NGAL在多种肿瘤的发生发展中发挥重要功能，是人类的一种新癌基因。

本研究通过检测NGAL蛋白在肺癌及癌旁组织中的表达发现NGAL在肺癌中阳性表达率远高于癌旁组织，说明NGAL的表达与肺癌发生发展存在一定的关联。已有研究[3,4]发现NGAL高表达肺癌，且于分化程度有关。这与我们报道的结果一致。

有研究发现在肺癌、乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌等肿瘤都有NGAL的表达，但没有进一步阐明NGAL在其中究竟发挥着何种作用。为了研究NGAL对肺癌细胞增殖、侵袭迁移能力的影响，本实验通过转染NGAL-SiRNA降低肺癌细胞中NGAL的表达，同时利用MTT、Transwell方法检测抑制NGAL的表达后，肺癌细胞增殖、侵袭迁移能力的变化，结果显示干扰NGAL表达的肺癌细胞增殖能力明显低于对照组；侵袭迁移能力显著降低。我们进一步利用细胞划痕实验发现抑制NGAL的表达后，肺癌细胞的划痕愈合能力明显下调。这些结果都表明NGAL在肺癌细胞的侵袭迁移过程中起着非常重要的作用。许多研究证实在其他癌症中，如乳腺癌、甲状腺癌，干扰NGAL后，能够抑制肿瘤细胞的侵袭迁移，而过表达NGAL后能够增强癌细胞的迁移增殖能力[5,6]。NGAL蛋白的表达水平与肿瘤细胞的S期分数和增殖指数Ki67正相关[7]。提示NGAL不仅与肿瘤发生发展有关，还在肿瘤的浸润和转移中具有一定作用，但其作用机制目前尚未明确。

图 4 干扰NGAL后，A549细胞迁移侵袭能力的检测。A：干扰NGAL后，细胞迁移能力的比较（P＜0.05）；B：干扰NGAL后，细胞侵袭能力的比较；C：干扰NGAL后，对细胞划痕损伤愈合能力的影响。与对照组比较，*P＜0.05，#P＜0.01。Fig 4 The ability of magration and invasion treated with NGAL-SiRNA or NGAL-Control SiRNA on A549 cells. A: The cell numbers of transwell migration treated with NGAL-SiRNA; B: The ability of invasion treated with NGAL-SiRNA; C: Effect of NGAL-SiRNA transfection on the wound healing ability of A549. Compared with control group, *P＜0.05, #P＜0.01.

图 5 干扰NGAL后，EMT相关蛋白的表达。A：免疫荧光检测干扰NGAL后，E-cadherin和Vimentin的表达；B：Western blot检测干扰NGAL后，E-cadherin和Vimentin的表达；C：Western blot检测干扰NGAL后，MMP-2和MMP-9的表达。Fig 5 Expression of EMT related marker protein treated with NGAL-SiRNA. A: E-cadherin and vimentin expression was detected by immunoflouresence after treated with NGAL-SiRNA; B: E-cadherin and vimentin expression was detected by Western-blot after treated with NGALSiRNA; C: MMP-2 and MMP-9 expression was detected by Western blot after treated with NGAL-SiRNA. EMT: epithelial-mesenchymal transition.

EMT在生物的发育、组织修复和肿瘤转移中发挥着重要作用，是癌症发展和肿瘤转移过程的重要标志性转变EMT的发生是以E-cadherin、细胞角蛋白等上皮性标志物表达下调，Vimentin、N-cadherin等间叶性标志物表达上调为特点，而且发生EMT的肿瘤细胞细胞间迁移和侵袭能力增强[8]。本研究发现在抑制NGAL的表达时，Vimentin蛋白表达降低，而E-cadherin蛋白表达明显升高，说明抑制NGAL的表达可抑制A549细胞的EMT转化，进而抑制细胞迁移和侵袭移动。在乳腺癌的研究中同样发现，干扰NGAL能够下调E-钙粘蛋白表达，参与表皮生长因子诱导的EMT，促进肿瘤的浸润和转移[9]。而多项研究[10,11]表明NGAL促进癌细胞侵袭行为的另一可能机制是NGAL蛋白能够与MMP-9形成复合物，增加MMP-9活性，促进细胞外基质的降解，促进新生血管的形成，增强肿瘤细胞迁移和侵袭的能力。本研究也证实了敲减NGAL后，MMP-2及MMP-9蛋白表达水平显著降低。还有研究[12,13]表明NGAL蛋白是一种新的铁离子转运载体，可以和铁高亲和力结合，促进肿瘤细胞的增殖。

综上所述，NGAL可作为肺癌发生、进展、迁移和侵袭等过程中一个重要的检测指标及潜在靶点，其在肿瘤发生发展中的机制和意义还有待进一步深入研究。