寒地大豆胞囊线虫生防菌的筛选及防治效果研究

迟君道，王笑庸，樊川，杨旭升（1.东北农业大学，哈尔滨15000；.黑龙江省科学院生物肥料研究中心，哈尔滨150086；.黑龙江省科学院，哈尔滨150001；.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨150086）

寒地大豆胞囊线虫生防菌的筛选及防治效果研究

迟君道1，2，王笑庸4，樊川2，杨旭升3
（1.东北农业大学，哈尔滨150030；2.黑龙江省科学院生物肥料研究中心，哈尔滨150086；
3.黑龙江省科学院，哈尔滨150001；4.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨150086）

在东北农业大学连作16年的大豆试验田中，分离筛选获得15株菌株作为研究对象，确定不同菌株对线虫胞囊的浸染效果，以及不同菌株发酵液及浸出液在不同处理时间内对大豆胞囊线虫二龄幼虫的抑制作用，评价不同菌株对大豆胞囊线虫的防治效果，最后确定生防效果较好的菌株。结果表明，与对照相比，有4个菌株对胞囊线虫的抑制作用有明显差异，其中1株对胞囊线虫的致死作用强烈。

生防因子；生物防治；胞囊线虫

黑龙江省大豆重迎茬现象普遍存在，导致大豆胞囊线虫发病率逐年提高，由于大豆胞囊线虫胞囊具有防护外壳，专性寄生于大豆根部，防治难度极大。生产中通过种植抗线虫品种、合理的耕作方式、灌溉、土壤沙化改良等方法，都能取得一定的防治效果，但这些方法都存在很大局限性。因受各种实际条件限制，黑龙江产区难以实行合理轮作，抗线育种虽然是一项经济有效且比较环保的措施，但存在丰产性、地域性等问题，也很难实现普及推广，所以抗线虫生防菌株的分离筛选被广泛应用研究［1-2］。

1　材料与方法

1.1试验材料

试验生防菌在连作16年的大豆试验田提取提纯，胞囊线虫在同一地块分离筛选。

1.2试验设计

试验于2013年8月——2014年7月于生物肥料研究中心实验室进行。试验分别将2×109/m L生防菌液1m L，均匀转至PSA培养基上，培养3d，将消毒后的胞囊10枚放入PSA培养基菌落附近。培养7d后，观察线虫生防菌对胞囊的浸染状况，并记录结果；分别用浓度为2×109/m L生防菌发酵液和浸出液测定对二龄幼虫的抑制作用，统计线虫死亡率。

1.3试验方法

1.3.1链霉菌的分离筛选

用平板稀释法进行生防菌株筛选，利用培养基平板进行拮抗性测定。用滤纸片法，观察在抗生菌周围是否会出现明显的抑菌圈。选择抑菌圈的大和透明度高的菌株作为试验菌株，被选定的4个菌株分别命名为HKS1405、HKS1406、HKS1407、HKS1408。

1.3.2土壤样品中的胞囊进行分离

将试验田中取回的土样加适量的水搅拌，使土样完全溶解，静置2～3m in后，把悬浮液倒入嵌在60目网筛中的40目网筛内，重复操作3次。去除上层网筛上的残余物，细水流把60目网筛上的沉积物中的泥沙缓慢冲去，剩余部分收集在干净的烧杯中。烧杯中的悬浮液经过多次缓慢淘洗，去除下层沉淀的泥沙，把上层样品倒入垫有双层擦镜纸的漏斗内过滤，把双层擦镜纸和过滤后的剩余物移入洗净的培养皿中，从中在解剖镜下用镊子挑取棕色新鲜饱满的胞囊，放入4℃冰箱备用。

胞囊线虫生防菌的分离与纯化。在培养皿底部垫上一张灭过菌的圆形定性滤纸，将包囊放置在滤纸上，盖盖标记好后，25℃下保湿培养7d。7d后，将表面长菌的胞囊挑出，在（PSA）固体培养基上，25℃培养。待菌落长出以后，切取菌落边缘的菌丝体转至PSA培养基中，25℃培养3d。3d后，将培养基上长出的菌体转入PSA斜面上进行保存

1.3.3二龄幼虫的制备

将试验中分离出的胞囊，加水研磨破壁，倒出混合液，过筛，收集60目下、270目上的物质，置于20m L离心管中。加入35%蔗糖溶液，2 500r/m in离心5m in。将离心后的液体用0.1%NaClO溶液中消毒3m in，然后用无菌水冲洗，完成二龄幼虫培养液的制备。

1.3.4线虫生防菌对大豆胞囊线虫胞囊的寄生性

将分离出的生防菌株转至PSA培养基上培养，到菌落直径长至培养皿1/2时，将消毒后的胞囊放入菌落边缘，每皿10个胞囊。培养7d后，将胞囊移除出培养皿，0.5%NaC lO表面消毒5m in，每个胞囊分别放于一个经过灭菌的滤纸片上，保湿培养7d。7d后观察长菌情况，了解菌株对胞囊的寄生性。

1.3.5发酵液对大豆胞囊线虫二龄幼虫的影响

将斜面培养的纯化菌落挑取在100m L无菌水中，调整菌悬液浓度为2×109/m L，分放于4个三角瓶中，用等量无菌水做对照，每瓶放置10条线虫，在25℃恒温箱中培养，12h、24h、36h、48h、60h、72h后观察线虫死亡情况，记录线虫僵直死亡率。

1.3.6浸出液对大豆胞囊线虫二龄幼虫活性的影响

将分离并纯化的菌株接种到PAS培养基上，25℃培养至菌丝长满斜面，分别向试管中加入10m L无菌水浸泡，于20℃培养箱内，7d后收集过滤液。取灭菌的贝氏小皿，每皿滴加过滤液10m L，分别加入10条二龄幼虫，3次重复，无菌水对照。在25℃下，分别于12h、24h、36h、48h、60h、72h镜检观察，确定线虫的僵直死亡率。

2　结果与分析

2.1不同线虫生防菌对大豆胞囊线虫胞囊的寄生性

表1　生防菌对胞囊的寄生率Tab.1 The parasitism rate of bio-controlbacteria to soybean cyst

统计数据说明，4个生防菌对胞囊线虫胞囊都有较强的寄生性，跟对照对比差异显著，其中HKS1408对胞囊的寄生率达到90%。

2.2发酵液对大豆胞囊线虫二龄幼虫的影响

表2　发酵菌液对胞囊线虫二龄幼虫的致死率Tab.2 The fata lity ra te of ferm entation bro th to soybean cyst nematode's second instar larvae

统计数据表明，4个生防菌的发酵液对二龄幼虫都有极强的抑制作用，在接触发酵液后，二龄幼虫游动频率逐渐减慢，数小时内部分虫体逐渐僵直，72h后大部分虫体僵直不动，少数未死亡虫体也接近僵直，游动缓慢。其中HKS1408在72h抑制率达到100%。

2.3浸出液对大豆胞囊线虫二龄幼虫活性的影响

表3　浸出液对胞囊线虫二龄幼虫的致死率Tab.3 The fatality rate of lixivium to soybean cyst nematode's second instar larvae

统计数据表明，4个生防菌的浸出液对二龄幼虫都有较强的抑制作用，接触12h内开始僵直死亡，对应不同时间段死亡率较发酵液略低，平均致死率也超过70%，其中HKS1408在72h抑制率达到90%。

3　结语

通过肉眼观察生防菌对胞囊线虫胞囊的浸染率以及通过镜检观察二龄幼虫对生防菌发酵液和浸出液的

反应，发现从大豆连作田中分离的4个生防菌株对大豆胞囊线虫胞囊都有较强的浸染作用，发酵液和浸出液对二龄幼虫的抑制作用也非常明显，其中HKS1408的抑制率几乎达到100%，由于以上4个菌株为寒地大豆重茬田中提取，因此可以确定该菌株很容易在寒地大豆土壤中定植，而且会在一定程度上起到抑制大豆胞囊线虫的作用［3-4］。

对以上4个菌株的浸出液中有效成分的分析鉴定有利于进一步确定其生防机制，也将为大豆生物防治产品的生产研究提供依据。

［1］陈井生，陈立杰，段玉玺，等.放线菌Snea49的分类鉴定及对胞囊线虫的活性评价［J］.大豆科学，2010，29（4）：663-635.

［2］国家大豆工程技术研究中心·发展战略部.关于黑龙江省大豆产业发展建议［J］.大豆科技，2010，（06）：33-35.

［3］刘冰.大豆胞囊线虫病的发生条件及防治措施［J］.现代农业科技，2011，（03）：186.

［4］杜春梅，李海燕，李晓明，等.HND1生物种衣剂防治大豆胞囊线虫药效研究［J］.大豆科学，2009，28（6）：1126-1129.

Research on Screening and Bio-contro l Effect o f Soybean Cyst Nem atode's Germ Strains in Co ld Regions

CHIJundao1.2，WANG Xiaoyong4，FAN Chuan2，YANGXusheng3
（1.Northeastern AgriculturalUniversity，Harbin 150030，China；2.Bio-fertilizer Research Center，HAS，Harbin 150086，China；3.Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150001，China；4.Institute ofMicrobiology，HAS，Harbin 150086，China.）

The research isolated 15 strains as the objects from the soybean experimental fields of Northeast Agricultural University，which lasted for 16 years'cropping soybean.The sutdy is to determine different strains' infection effect to nematode cyst and inhibition of fermentation br oth and lixivium of differentstrains to juvenile in different processing time.The ultimate object is to analyze and assess the bio-control effect of different strains to Soybean CystNematodeand finally tomake sure the strainswith betterbio-controleffects.The resultsshowed that byway of contrast therewere obvious differences in inhibition of four strains to CystNematode.It found out thatone of four strainshad very strong lethaleffectto CystNematode.

Bio-control factor；Biological control；Cystnematode

S435.651

A

1674-8646（2015）05-0020-03