磁标记骨髓间充质干细胞对不同转移潜能肝癌细胞作用的研究

王 强，巩 鹏，金 实，谭 广，王洪江，郭慧淑，董 擂，李克军，程 雷

(大连医科大学 附属第一医院 普通外科，辽宁 大连 116011)

磁标记骨髓间充质干细胞对不同转移潜能肝癌细胞作用的研究

王 强，巩 鹏，金 实，谭 广，王洪江，郭慧淑，董 擂，李克军，程 雷

(大连医科大学 附属第一医院 普通外科，辽宁 大连 116011)

目的 探讨磁标记骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)对具有不同转移潜能肝癌细胞的作用。方法 采用全骨髓培养法分离培养BMSCs，流式细胞仪测定BMSCs表面分子CD29、CD44、CD45。对BMSCs进行超顺磁性氧化铁(SPIO)标记。对SPIO标记BMSCs分别与高低转移性肝癌细胞MHCC97-H和MHCC97-L的共培养及流式细胞仪鉴定。结果 普鲁士蓝染色显示BMSCs的磁标记率近95%, CD29、CD44呈阳性表达。SPIO标记BMSCs 对高低转移性肝癌细胞的生长均有抑制作用,组间和组内比较均有明显差异，P<0.05。 结论 SPIO标记BMSCs 对高低转移性肝癌细胞具有抑制作用，其机制有待于进一步研究。

骨髓间充质干细胞；肝细胞癌；超顺磁性氧化铁

1974年首次从骨髓中分离获得骨髓间充质干细胞(bone mesenchynal stem cells， BMSCs)[1]，BMSCs具有高度自我更新能力，在一定的条件下能分化为成骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞、软骨细胞、神经元细胞和肝细胞等，并且体外培养相对容易获得，是其能够进行细胞治疗的基础。随着干细胞临床应用的发展，干细胞进入体内如何分布、迁徙、分化及代谢转归，其生物学行为如何监测，成为评价治疗效果的关键，本研究旨在为进一步优化干细胞治疗方案提供依据。

1 材料和方法

1.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化和培养

取1～2个月月龄80～100 g SD大鼠1只，购自大连医科大学动物实验中心，断颈处死。无菌条件下分离股骨、胫骨，用DMEM培养液5 mL冲出骨髓腔内的骨髓，离心，去除上清液，将沉淀接种于25 mL塑料培养瓶中，于37 ℃、5%的CO2饱和湿度培养箱中培养。48 h后换培养液，以后每2～3天换液1次，通过换培养液，弃掉悬浮的非骨髓间充质干细胞，获得贴壁生长的BMSCs。纯化后，按1∶2比例传代培养。

1.2 BMSCs的鉴定

1.2.1 流式细胞仪测定BMSCs表面分子CD29、CD44、CD45:收集P3代生长良好细胞，用0.25%胰酶消化成单细胞悬液，吹打均匀，4 ℃ 1 000 r/min离心5 min，收集细胞沉淀，用PBS清洗细胞3遍。细胞计数，平均分到6个管中，依次加入抗CD29-FITC抗体、抗CD44-FITC抗体、抗CD45-FITC抗体、剩余3管不加任何抗体，做各管空白对照。4 ℃避光，培育45 min，PBS冲洗3遍后放入冰盒，避光，流式细胞仪进行检测分析。

1.2.2 超顺磁性氧化铁(SPIO)标记BMSCs及鉴定:将配制好的SPIO培养液5 mL加至第4代BMSCs培养液中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后胰蛋白酶消化,PBS重悬,计数后备用。台盼蓝染色, 取第3代BMSCs，待细胞长至80%时用0.25%胰蛋白酶1 mL消化成细胞悬液，1 000 r/min离心5 min。向上述0.5 mL细胞悬液中加入0.4%的台盼蓝溶液0.5 mL，混匀，静置5 min。

1.2.3 高低转移性肝癌细胞MHCC97-H和MHCC97-L的培养(细胞株购自上海复旦大学肝癌研究所):使用100 mL玻璃培养瓶加5 mL完全培养基,平放于CO2恒温培养箱中培养,细胞生长至80%融合度时,胰酶消化传代。

1.2.4 SPIO标记BMSCs分别与高、低转移性肝癌细胞MHCC97-H和MHCC97-L的共培养及流式细胞仪鉴定:分别取对数生长期状态良好、SPIO标记BMSCs和高低转移性肝癌细胞[MHCC97-H(HH)和MHCC97-L(HL)]，SPIO标记BMSCs分别与肝癌细胞MHCC97-H及MHCC97-L按1∶1组、2∶1组、4∶1组及8∶1组加入培养基中，共8组，每两天换液。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 BMSCs磁标记的鉴定

2.1.1 BMSCs的表面标记物：取第3代BMSCs，流式细胞仪检测其相应抗体，结果显示：CD29细胞计数阳性率为98.34%，CD44细胞计数阳性率为97.53%，CD45细胞计数阳性率为3.1%，符合BMSCs的表面抗原特性。台盼蓝染色染色显示细胞胞质内见较多蓝染颗粒,标记率达95%以上。

2.1.2 BMSCs磁标记细胞与高低转移性肝癌细胞MHCC97-H和MHCC97-L生长曲线比较：采用CCK8方法，酶联免疫检测仪器测定各共培养组细胞450 nm波长的OD值，连续7天。以天数为横坐标、OD 值为纵坐标绘制 hBMSCs 和不同肝癌CD29阴性细胞的生长曲线。

利用流式细胞仪检测各共培养组细胞，1～7天CD29 的阴性细胞计数表达率见表1，与 CCK8 方法检测的各共培养组细胞 OD 值(表 2)相乘，得出不同天数、各共培养组CD29阴性细胞的 OD 值，绘制各共培养组CD29阴性细胞生长曲线，见图1。

BMSCs磁标记细胞对于MHCC97-H和MHCC97-L细胞生长有抑制作用，随着BMSCs浓度越高，抑制程度越来越明显。BMSCs磁标记细胞对于MHCC97-H和MHCC97-L细胞生长的抑制,组间比较差异有显著性意义(P<0.05)，并且对于MHCC97-H组抑制更明显。

3 讨 论

最新的分子影像学技术，主要是MR和MSCs 的磁性纳米颗粒标记技术的进步为开展本研究奠定了基础。利用磁对比剂标记细胞进行 MR 成像是移植细胞定位及迁徙情况的重要监测手段[2-3]。超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide，SPIO)作为 MRI 对比剂，已用于多种干细胞的标记和移植后的活体示踪[4]，其中MSCs 的磁性纳米颗粒标记技术可以观察MSCs 的定向迁移及消灭肝癌组织和修复过程中MSCs 的动态变化，以及MR多参数评价肝癌形态学的演变[5-8]。本实验设计利用磁性纳米颗粒标记MSCs对具有不同转移潜能肝癌细胞的作用和影响，为体内实验应用影像学技术评价MSCs对肝癌高低转移潜能的影响作准备。

表1 共培养各组连续 7 天的 CD29 阴性表达率Tab 1 CD29 negative expression rate in co-cultured group for seven days (%)

表2 不同细胞培养组1～7天的 450 nm处的OD值Tab 2 OD values of 450 nm in Different cell culture group for 1-7 days ±s)

图1 CD29阴性表达细胞生长曲线Fig 1 Growth curves of CD29 negative expression cells

BMSCs可抑制肝癌细胞增殖，BMSCs在肝癌细胞治疗中的研究尚处于初级阶段,其抑制肝癌细胞增殖的具体机制目前尚不清楚,可能通过以下几个途径得以实现：(1)通过抑制恶性肿瘤细胞分子蛋白激酶B(Akt)激活实现，Akt是磷脂酰肌醇3激酶—分子蛋白激酶B通路(PI3K-Akt信号通路)的核心组成部分，该通路调节肿瘤细胞的存活和增殖, 其活性异常不仅能导致细胞恶性转化, 而且与肿瘤细胞的迁移、黏附、肿瘤血管生成以及细胞外基质的降解等相关；(2)在人MSCs对肿瘤细胞的Wnt信号通路抑制中起作用，Wnt信号通路包含许多信号成员蛋白,其中任何一个成员蛋白的突变或异常均可激活Wnt信号通路引起细胞异常增殖而导致肿瘤的发生；(3)MSCs能分泌大量的血管生成因子，包括angiopoietin1(Ang1)，Angl能抑制肿瘤-血管泄漏，抑制肿瘤生长；(4)MSCs主要位于肿瘤边缘，形成被囊样结构，这种独特的MSCs分布可能形成一种屏障防止肝癌细胞进入正常的肝组织内[9-15]。MSCs在原发性肝癌中的治疗机制相当复杂，目前尚未完全阐明。MSCs诱导分化为肝细胞的研究是细胞生物学领域的热点之一，而MSCs作为骨髓中一种主要的具有多向分化潜能的成体干细胞，来源广泛，体外培养扩增容易，同样也被证实在体外诱导剂及肝内微环境作用下可以分化为具有正常功能的肝样细胞或肝细胞 ，因此MSCs作为种子细胞在治疗肝脏疾病方面具有很好的前景。根据前述文献分析可知MSCs 促使恶性肿瘤细胞分子蛋白激酶B(Akt)激活通路的失活与肝癌的增殖有关，与肝癌细胞的迁移、黏附、肿瘤血管生成以及细胞外基质的降解等相关，而这些机制也是包括肝癌在内肿瘤细胞转移的必经过程，因此，可以假设认为MSCs 不但通过多种途径抑制肝癌细胞的存活和增殖，也抑制肝癌细胞侵袭转移的发生，MSCs 对具有高低不同转移特性肝癌的转移潜能影响程度也应不同[16-21]。

本实验中体外培养的BMSCs通过流式细胞仪检测显示细胞均一性较好，表达高水平CD29和CD44，CD45表达率极低，符合BMSCs的特点。台盼蓝染色染色显示细胞胞质内见较多蓝染颗粒, 磁性纳米颗粒标记率达90%以上。

本研究结果显示，BMSCs能在一定程度上抑制MHCC97-H和MHCC97-L的生长，且不同浓度磁标记BMSCs的抑制程度不同，浓度越高抑制越明显，并且对于MHCC97-H的作用更显著。其体外实验的结果还需要今后进一步验证。

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Effects of magnetically labeled bone mesenchymal stem cells to hepatocellular carcinoma cells with different metastatic potential

WANG Qiang, GONG Peng, JIN Shi, TAN Guang, WANG Hong-jiang,GUO Hui-shu, DONG Lei, LI Ke-jun, CHENG Lei

(DepartmentofGeneralSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China)

Objective To label rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) with superparamagnetic iron oxide (SPIO) and to explore the curative effects of BMSCs to hepatocellular carcinoma cells with different metastatic potential. Methods BMSCs were isolated and purified from bone marrow of Sprague-Dawly (SD) rats and cultured in vitro. Detect the surface markers (CD29,CD44,CD45) of BMSCs by flow cytometry and lable BMSCc with SPIO. Results Immunohistochemistry showed positive expression of CD29 and CD44 of BMSCs. Prussian blue stain confirmed that the labeling efficiency of SPIO was above 95%. SPIO-labeled BMSCs inhibited the growth of hepatocellular carcinoma cells with different metastatic potential (MHCC97-H and MHCC97-L). The differences were significant within the groups and between the groups,P<0.05. Conclusion SPIO-labeled BMSCs could inhibit the growth of hepatocellular carcinoma cells with different metastatic potential. The mechanism should be studied further.

bone mesenchymal stem cells; hepatocellular carcinoma; superparamagnetic iron oxide (SPIO)

论 著

10.11724/jdmu.2015.01.03

辽宁省科技计划项目(2013225002)

王 强(1990-)，男，山西朔州人，硕士研究生。E-mail:278063060@qq.com

程 雷，教授。E-mail:docchengleii@163.com

R735.7

A

1671-7295(2015)01-0013-04

王强，巩鹏，金实，等. 磁标记骨髓间充质干细胞对不同转移潜能肝癌细胞作用的研究[J].大连医科大学学报，2015,37(1)：13-16.

2014-11-15；

2014-12-25)