VEGF基因多态性与2型糖尿病视网膜病变的相关性*

福建医科大学附属第一医院　陈鲤敏　徐国焱　谢茂松　徐国兴

VEGF基因多态性与2型糖尿病视网膜病变的相关性*

福建医科大学附属第一医院陈鲤敏徐国焱谢茂松徐国兴

目的：探讨血管内皮细胞生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）基因启动子rs699947（-2578C/A）多态性与糖尿病视网膜病变（DR）的相关性。方法：提取161例并发DR的2型糖尿病患者（病例组）和213例未并发DR的2型糖尿病患者（对照组）的 DNA，PCR反应扩增含rs699947（-2578C/A）位点的 DNA片段，限制性内切酶Bgl II酶切，测定rs699947（-2578C/A）基因多态性。结果：糖尿病视网膜病变组VEGF rs699947（-2578C/A）基因 AA型基因频率高于对照组，CC基因型明显低于对照组。糖尿病视网膜病变危险因素的多元逐步Logistic回归分析显示，血糖、高血压、高血脂是糖尿病的独立危险因素，携带VEGFrs699947 AA基因型的2型糖尿病患者发生DR的危险性明显增高。结论：VEGF基因启动子-2578C/A多态性与DR病有关，携带AA基因型的2型糖尿病患者发生DR的危险性较高。

糖尿病视网膜病变血管内皮细胞生长因子基因多态性

糖尿病视网膜病变（Diabetic Retinopathy，DR）是糖尿病最常见和最严重的微血管并发症之一，发病率高，后果严重，加强对易感人群筛查和预防的研究具有十分重要的意义，对其病因和预防的研究是热点。家族聚集性、同卵双生子较高的一致性及某些种族中的高发率均强烈提示DR有遗传易感性［1-2］，说明除了糖尿病病程、血糖水平、高血压等高危因素之外，遗传因素在DR的发生发展中也起了重要作用。因此，DR是由不同致病机制造成且与遗传和环境相关的多因子疾病。

VEGF是DR发生发展中刺激新生血管生长和导致血管高渗透性的首要因素。临床研究显示，在PDR患者的玻璃体和房水中VEGF表达明显增高。近年来，VEGF的单核苷酸多态性位点与DR的相关性关系研究倍受关注。为探讨VEGF基因启动区-2578C/A单核苷酸多态性与DR发病的关系，我们于2009年10月～2014年10月进行了如下研究。

1　资料

1.1临床资料

选择2009年10月～2014年10月收治的2型糖尿病患者374例为研究对象，其中男198例，女176例，年龄40～70岁，病程0～20年，均为汉族，相互间无血缘关系。根据1999年世界卫生组织制定的糖尿病诊断标准确诊。根据是否发生DR分为实验组和对照组，其中实验组161例，对照组213例。除外酮症酸中毒、心力衰竭、高血压危象、妊娠。

1.2糖尿病视网膜病变诊断标准

根据眼底照相及眼底血管荧光造影结果提示微血管瘤形成、渗出、出血等改变，并按照2002年悉尼国际眼科会议制定的DR分型新标准进行诊断分期。根据检查结果，凡符合上述条件之一者即入选为实验组。

2　方法

2.1标本采集

所有被检者均禁食12～14h，晨起空腹抽取静脉血5 mL，在抗凝管中混匀，置于-80℃保存，其中2mL用作DNA提取，另3mL静脉血分离血清行三酰甘油（triglyeeride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）和血糖测定，并且测量血压。

2.2DNA的提取与扩增

两组均于入院次日清晨采集空腹静脉血5mL，加EDTA抗凝，-80℃保存。用百泰克公司中量全血基因组DNA提取试剂盒提取全血DNA。

2.3VEGF C-2578-A多态性基因型测定

采用PCR法行DNA扩增。VEGF基因上游引物序列5′-GCACCTCCACCAAACCACAGCAACAT-3′，下游引物序列为5′-CAAGCCCCCTTTTCCTCCAACTCTCC-3′（由TaKaRa公司合成）。PCR反应体系中各组分的终浓度为DNA样本0.5μg，10×PC Buffer2.5μL，Taq DNA聚合酶2.5U，dNTPs 0.2μmol/L，上下游引物各0.4μmol/L，灭菌纯净水补足体积至25μL。扩增条件：95℃预变5min，95℃1min，66℃1min，72℃1min，循环35次，72℃延伸7min。于2%琼脂糖凝胶电泳，恒定电压90V，紫外透射反射仪下观察结果。

2.4VEGF基因C-2578-A多态性检测

取10μLPCR产物，加限制性内切酶Bgl II（10U）1μL，10×Buffer2μL，双蒸水（ddH2O）7μL，组成20μL的反应体系。 置于37℃恒温水浴箱中反应6h。酶切反应结束后，取10μL酶切产物与2μL上样缓冲液混合均匀，置于琼脂糖凝胶，在恒定电压90V、紫外透射反射仪下观察结果。计算VEGF基因-2578C/A等位基因频率、等位基因频率 VEGF基因-2578C/A多态性与DR关系。

2.5统计学分析

采用Hardy-Weinberg平衡分析法检验各组基因型频率的群体代表性。采用SPSS11.0版软件包对实验组和对照组的基因型和等位基因频率分布进行χ2检验，DR危险因素分析使用多元逐步Logistic回归。

3　结果

3.1研究对象的一般资料比较

各组年龄差异的比较采用t检验，结果显示，年龄构成差异无统计学意义（P＞0.05）。各组性别差异的比较采用χ2检验，结果显示，性别构成差异无统计学义（P＞0.05）。

3.2VEGF基因PCR扩增产物的酶切结果

VEGF rs699947 PCR扩增片段，经Bgl II限制性内切酶消化可产生3种基因型。

图1　VEGF基因限制性内切酶切产物电泳结果（部分）

3.3DR危险因素的多元逐步Logistic回归分析

将所有研究对象作为整体进行分析。以VEGF基因rs699947位点的等位基因、血脂（TG、TC）、血压（收缩压、舒张压）和血糖各影响因素为自变量，以有无DR为因变量进行多因素多元逐步Logistic回归分析。结果发现，血糖、高血压、高血脂是糖尿病的独立危险因素，携带VEGF rs699947 AA基因型的2型糖尿病患者发生DR的危险性明显增高。

3.4DR组与对照组

VEGF基因rs699947位点基因型频率及等位基因分布频率的比较。DR组与对照组的VEGF基因均存在CC、CA、AA 3种基因型，其分布符合Hardy-Weinberg平衡法，说明达到遗传平衡，具有群体代表性。如表1所示，VEGF基因rs699947位点基因型频率及等位基因频率在研究组和对照组间的差异均具有统计学意义（P＜0.05）。DR组基因型与对照组相比，AA基因型明显增高，CC基因型明显降低（P=0.04，P＜0.05），其等位基因A频率则明显高于对照组。携带rs699947AA基因型的糖尿病患者发生DR的危险性较rs699947CC基因型及CA基因型携带者高。

表1　DR组与对照组VEGF基因rs699947位点基因型频率及等位基因频率的比较

4　讨论

糖尿病视网膜病变是一个多因素、多环节致病的复杂病理生理过程。遗传背景、环境因素以及两者的相互作用在其发生、发展的过程中均发挥着重要的作用。本实验结果提示，高脂血症、糖尿病和高血压等都是促使DR发生的重要危险因素。同时通过多元逐步Logistic回归分析显示，血糖、高血压、高血脂是糖尿病的独立危险因素，这符合DR的一般规律。VEGF基因存在多个单核苷酸多态性位点，糖尿病视网膜病变研究最多的通常位于启动子区、5’非翻译区和3’非翻译区。VEGF基因多态性位点rs699947位于VEGF基因的启动子区域。本研究发现，其中携带rs699947 AA基因型的糖尿病患者发生糖尿病视网膜病变的危险性较高。VEGF基因rs699947位点基因型频率及等位基因频率在DR组和对照组间的差异均具有统计学意义。

VEGF是DR发生发展中刺激新生血管生长和导致血管高渗透性的首要因素。临床研究显示，在PDR患者的玻璃体和房水中VEGF表达明显增高。近年来，VEGF的单核苷酸多态性位点同DR的相关性关系研究倍受关注，迄今为止，这方面的研究在欧洲白种人群、亚洲日本人群和印度人群已有报道，但尚未有统一明确的结论。高加索人VEGF基因多态性与DR的严重程度有明确关系［3-5］，有研究认为VEGF基因多态性可作为印度人群DR的主要遗传风险因素［6］。 Koji Nakanishi等发现，在日本人群的1型糖尿病患者中VEGF内含子2的单核苷酸多态性可作为DR进展的早期指标［7］。而Kangas-Kontio等则认为VEGF基因型多态性与DR无显著性相关［8］。国内学者通过meta分析对VEGF-2578C/A基因多态性与DR的发生发展的相关性也存在着分歧［9-10］。以上分歧考虑与所取样本人群种族、研究人群的入选标准不同有关。关于VEGF-2578C/A基因多态性与DR的关联性以及影响DR发生发展的机制，还有待进一步扩大样本量并进一步深入研究。

［1］Arar NH，Freedman BI，Adler SG，et al.Heritability of proliferative diabetic retinopathy：the FIND Eye study［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2008（49）：3839-3845.

［2］Hietala K，Forsblom C，Summanen P，on behalf of the FinnDiane Study Group.Heritability of proliferative diabetic retinopathy［J］.Diabetes，2008（57）：2176-2180.

［3］Amanda J.Churchill，1 James G.Carter，et al.VEGF polymorphisms are associatedwithseverityofdiabeticretinopathy［J］.Investigative Ophthalmology&Visual Science，2008，4（8）：3611-3616.

［4］Sotoodeh Abhary，Kathryn P.Burdon，Aanchal Gupta，et al.Common sequence variation in the VEGFA gene predicts risk of diabetic retinopathy［J］. Investigative Ophthalmology&Visual Science，2009，50（12）：5552-8.

［5］Al-Kateb H，Mirea L，Xie XL，et al.Multiplevariants in vascular endothelial growth factor（VEGF）gene are risk factors for severe retinopathy in type I diabetes：the DCCT/EDIC genetics study［J］.Diabetes，2007（56）：2161-2168.

［6］Balasubbu S，Rajendran A，Ramasamy K，et al.Association of VEGF and Enos gene polymorphisms in type 2 diabetic retinopathy［J］.Molecular Vision，2006（12）：336-41.

［7］Koji Nakanishi，Chizuru Watanabe.Single nucleotide polymorphisms of vascular endothelial growth factor gene intron 2 are markers for early progression of diabetic retinopathy in Japanese with type 1 diabetes［J］. Clinica Chimica Acta，2009，402（1-2）：171-175.

［8］Kangas-Kontio T，Vavuli S，et al.Polymorphism of the manganese superoxide dismutase gene but not of vascular endothelial growth factor gene is a risk factor for diabetic retinopathy［J］.Br J Ophthalmol，2009，93（10）：1401-1406.

［9］Lu Y，Ge Y，Shi Y，et al.Two polymorphisms（rs699947，rs2010963）in the VEGFA gene and diabetic retinopathy：an updated meta-analysis［J］.BMC Ophthalmol，2013（13）：56.

［10］Han L，Zhang L，Xing W，et al.，The associations between VEGF gene polymorphisms and diabetic retinopathy susceptibility：a meta-analysis of 11 case-control studies［J］.J Diabetes Res，2014：805801.

福建省自然科学基金（项目编号：2012J01344），通讯作者：徐国兴。