性别控制技术的研究进展及在工作犬繁育中的应用

张汇东 高一龙 温 海

性别控制是指通过对动物的正常生殖过程进行人为干预、能使成年雌性动物产出人们期望性别后代的生物技术，对家畜育种、生产性能提高和遗传疾病的预防有非常重要的作用。当前国内外性别控制技术主要有两种途径：X/Y精子的分离和胚胎的性别鉴定。其中流式细胞仪分离X/Y精子法，是在受精之前就可以控制人们所需性别后代的一种技术，是当前控制性别最有效的方法，其性别控制准确率可以达到90%左右，已在畜牧业生产中产生了明显的经济效益。本文简述了哺乳动物性别控制的原理以及技术方法，并结合犬X/Y精子分离实验的科学研究进展，展望了该技术在工作犬繁育中的应用前景。

一、性别控制的方法

（一）X/Y精子分离法控制性别

目前主要根据X、Y 精子的物理学、免疫学和生物学差异进行分离，主要有：以X、Y精子DNA含量差异为基础的流式细胞仪分离法； 以精子所带电荷性质为基础电泳分离法；以精子比重大小差异为基础的沉降分离法；以Y精子特有抗原为基础的免疫分离法等。

1.流式细胞仪精子分离技术

（1）流式细胞仪精子分离法的发展

流式细胞检索仪问世于20世纪60年代， 起初主要应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、生物化学等临床医学和基础医学的研究。Gledhill等首先利用流式细胞仪测定精子的DNA含量，1989年Johnson等报道用流式细胞仪成功地分离得到兔子活的X和Y精子并通过手术方法人工授精产下后代。此后，其它动物(牛、羊、猪等)的活精子相继分离成功，并用分离的精子通过各种途径，如AI（人工授精)、IVF（体外受精)、ICSI（细胞质内精子注射)等产下了预知性别的后代。

（2）流式细胞仪分离精子的原理

哺乳动物中通常情况下X染色体较Y染色体大,所以X精子的DNA含量也会高于Y精子。一般认为,当动物的X精子和Y精子的DNA含量差异大于3.5%时,就能用流式细胞仪进行分离。研究证明，X精子和Y精子DNA含量差异越大的物种越容易分离，犬的X精子和Y精子DNA含量的差异为3.9%,理论上可以通过分离精子进行性别控制。

流式细胞仪分离技术采用荧光素Hochest33342对精子进行染色，由于X精子的DNA含量高于Y精子,所以在激光照射下发出的荧光也比Y精子强，通过X精子和Y精子分离仪光电信号的相互转变,使活力旺盛的X精子和Y精子得到有效分离,而活力差以及畸形的精子在分离过程中被剔除,并通过人工授精、体外受精等技术,使雌性动物产下预知性别的后代。

（3）流式细胞仪分离精子的应用

英国的Cogent公司于2000年首先开始将性别分离精子投入商业使用，为其下属牧场主提供奶牛分离精子的服务。目前已有包括美国、中国、加拿大、墨西哥、阿根廷等国家相继进入精子分离产业化应用行列。我国内蒙、新疆、黑龙江、广西等省市自治区都纷纷引进该分离仪器进行精子分离试验。

在国内，王建国等采用流式细胞分离法获得的性控冻精对奶牛进行人工授精,母犊出生准确率为93.3%, 极显著高于普通冻精的母犊率，高庆华和魏海军于2006年9月和2007年9月成功分离梅花鹿和马鹿精液，速度已能达到每秒分离X、Y精子各4500个，纯度均超过91%，并且进行了直肠把握子宫颈法(对马鹿)和内窥镜法(对梅花鹿)的低剂量冻精输精试验,后代的性别比与输精的X、Y精子纯度均高度吻合。随着流式细胞检索仪的改进和相关技术的进步，养牛业中性控精液已商业化使用，绵羊、马和鹿等也开始进入了实用阶段。

2.沉降分离法

X/Y精子流式分离原理示意图

沉降法的原理是X精子的比重大于Y精子，因此沉积速率也大于Y精子。在重力的作用下，经过一段时间的沉降，X和Y精子可部分分离。但是X 和Y精子的比重差异较小, 此方法不能完全分离精子，因而效率和准确率都不高，生产实践中很少使用。经过改进的密度梯度离心分离法原理和沉降法相同，用离心力取代沉降，但效果仍不足以进行商业应用。

3.电泳分离法

X和Y精子表面所带电荷量不同,在电场中的运动速率也有所差别，所以可通过电泳将X与Y精子分离。但近年来的实验发现, 电泳法准确率不高, 重复性较差，而且会对精子造成比较大的损伤，所以此方法在生产实践中也比较少用。

4.免疫学分离法

免疫法利用免疫反应识别X和Y精子。H-Y抗原只有在Y精子表达,所以可利用H-Y抗原和特异性抗体结合将两类精子分离。但此方法对精子处理的时间过长,影响精子活力,应用受限。

（二）胚胎鉴定的性别控制方法

1.细胞学方法

细胞学方法通过鉴别胚胎细胞核型来确定胚胎性别。该方法准确率非常高，甚至可达到100%，但由于过程繁琐，对操作人员以及实验仪器的要求较高等一系列原因，限制了该技术在生产实践中的应用。

2.免疫学方法

免疫学方法是通过H-Y抗血清或H-Y单克隆抗体检测胚胎上雄性特异性H-Y抗原, 存在H-Y抗原为雄性, 否则为雌性。常用的检测胚胎H-Y抗原的方法是间接免疫荧光法。该方法在准确率和效率方面有所欠缺，应用不广泛。

3.分子生物学方法

分子生物学方法是随着分子生物学理论和实验技术快速发展而出现的一种通过检测Y染色体上SRY基因来鉴别动物胚胎性别的方法,存在SRY基因为雄性, 否则为雌性, 应用最多的有DNA 探针法和PCR 扩增法。由于分子生物学方法有准确、快速的优点，已广泛应用于动物胚胎性别鉴定中。

二、性别控制技术在工作犬繁育中的作用和应用前景

（一）性别控制在工作犬繁育中的作用

1. 满足警方在各个专业方向对不同性别警犬的使用需求

在警犬的使用过程中，由于性别差异，公犬和母犬在凶猛性、嗅觉灵敏性、训练使用的耐力和持久性等警用性能方面各有特点。基层一线的使用实践证明，虽然母犬在气味作业过程中嗅认仔细程度好于公犬，但公犬体格比母犬高大，凶猛性普遍高于母犬，且公犬在追踪耐力和作业持久性等方面优于母犬，所以在巡逻、治安防范等领域的基层带犬民警倾向于挑选公犬进行训练、执行任务；母犬性成熟后，平均每年发情两次，发情期间其警用性能普遍下降；在大型安保活动中，一只母犬发情就会影响到一群执行安保任务的其他警犬（公），不能正常工作。因此，一般而言公犬比母犬更受带犬民警的欢迎。通过性别控制无疑可以增加公犬繁殖比例，以满足一线带犬民警的用犬需求。

2.减少伴性遗传病高危犬系家族后代的患病几率

目前发现有很多种犬类伴性遗传病，如与X染色体关联的犬类遗传疾病：血友病、重度联合免疫缺陷症、肌肉萎缩症、渐行性视网膜萎缩等。对于这些与X染色体关联的伴性遗传病高危犬群家族，可以采用性别控制技术，繁殖雌性胎儿，以降低伴性遗传病高危犬系家族后代的患病的几率。通过合理实施性别控制，可以减少警犬伴性遗传病发病几率，实现优繁优育，提高犬群的遗传素质和警用性能。

3. 增加遗传和表型性别的选择强度

控制警犬后代的性别比例，可增加选种强度，最大限地发挥良种公犬的遗传繁殖潜力，加快优质种公犬遗传基因的传播速度，加快遗传进展。这项技术的广泛应用必将对优质种公犬扩群、优化犬群结构、犬群整体警用性能的提高等方面产生重大影响。

（二）工作犬性别控制技术的研究进展和应用前景

虽然国内外现在对牛、羊、鹿等哺乳动物，利用流式细胞仪分离精子进行性别控制技术的研究开展得如火如荼，比如奶牛的性控精液已经实现了商业化生产和应用，取得了较好的经济效益。但在犬的性别控制技术方面，国内外鲜见报道，还没有成功系统的研究。主要由于犬特殊的生理生殖特性，国内外对于犬的人工授精、体外受精、细胞质内精子注射等技术还不是很成熟，导致流式细胞仪分离XY精子的性别控制技术的应用受到了很大限制，但国内外的研究人员还是对工作犬的流式分选XY精子开展了少量实验研究。

M·A·Meyers等（2007）对拉布拉多犬的鲜精进行了流式细胞仪分选X/Y精子的实验研究，结果表明分离后的X/Y精子的平均纯度约为82%, 分离后的Y精子直接进行人工授精，实验母犬生产了5头仔犬（3公，2母），性控准确率为60%；Barbara Merlo等（2015）采集了14头杂种/纯种雄性犬的精液，对其稀释染色后分离X/Y精子，并研究了分离后冷冻稀释液的配方以及低温存储的流程，结果表明X/Y精子的分离效果较好，纯度可以达到85%左右，但解冻后的活力只有2.4 ±1.2%，因此还需进一步研究流式分离后的冷冻稀释保护液的配方以及低温存储的流程。

国内也有相关机构开展了此类的研究，但截至目前并无成功系统研究的公开报道。公安部南京警犬研究所通过开展犬人工授精和胚胎移植等项目的研究工作，熟练掌握了人工授精和胚胎移植等关键技术，在犬的现代繁殖生物技术方法方面积累了丰富的经验。 《性别控制技术在警犬培育中的应用》项目研究团队，经过近三年的实验研究，目前取得了系列进展：已经成功分离出工作犬的X/Y精子，其平均纯度在85%以上，分离后的X/Y冷冻性控精液也成功受孕，Y精液受孕母犬产仔3窝（16公，4母），X精液受孕母犬产仔1窝（5母，1公）。但在研究过程中，我们也发现工作犬的X/Y精子流式分选对受试种公犬的精子质量要求很高，品种和个体差异性都较大，技术参数不稳定。且相对牛、鹿等哺乳动物，精子分选的速率不高，流式分选的经济成本也较高，想要实现由实验室到实际繁育生产中的大规模的推广应用任重道远。

相信随着相关技术的进步和仪器设备的改进,流式细胞仪等分离精子的方法会越来越完善, 经济成本也会越来越低，犬精子流式分选性别控制技术在工作犬繁育生产中的应用前景也越来越广泛，必将产生巨大的经济效益和社会效益。