2种在组织切片上鉴别兔脑炎原虫的新方法

李瑞珍，刘志科，梁莹莹，郝军红，赵俊江，潘耀谦（河南科技学院动物科学学院，河南新乡 453003）

脑炎原虫病（Encephalitozoonosis）是由兔脑炎原虫（Encephalitozoon cuniculi）所引起的一种人畜共患病。据报道，兔脑炎原虫是一种专性细胞内寄生的微孢子虫，可感染人、啮齿动物、肉食动物、家畜和家禽等［1－3］。其中，家兔是脑炎原虫的自然宿主，发病后出现典型的神经症状，故又将此病称为兔脑炎原虫病［4－5］。在自然条件下，兔脑炎原虫的隐性感染率很高，所以对活兔的脑炎原虫病的诊断比较困难。一般认为，血清学特异性抗兔脑炎原虫抗体的检出仅能证明病兔受过脑炎原虫的感染［6－7］，而若要确诊必须从脑组织特异性肉芽肿、病变的肾组织或排泌物中检出兔脑炎原虫。据报道，一些组织化学的特殊染色方法在涂片上可使兔脑炎原虫特异性着染，如革兰氏染色呈蓝色、过碘酸雪夫氏染色呈淡红色、Goodpasture染色呈红色等［8－10］。但在病理组织切片中，这些特殊染色法有的受制于切片处理过程中有机溶剂的作用而脱色，使组织不着色，有的则因切片染色后反差较小不便观察而容易造成误诊。为此，笔者改良了革兰氏染色，并根据脑炎原虫代谢的特点选用甲基绿派诺宁法对其进行染色，在病理组织切片上鉴别兔脑炎原虫方面取得了良好效果。

1 材料与方法

1．1 病兔来源 5只病兔来自河南省某獭兔养殖场，临床上具有兔脑炎原虫病的特异性神经症状，初步诊断为兔脑炎原虫病，亟需通过病理组织学和特殊染色进行确诊。

1．2 剖检及切片 用乙醚麻醉病兔后进行了剖检。首先进行了详细的外部检查，接着打开胸腹腔对肾脏、肝脏、脾脏、心脏和肺脏等内脏器官进行了检查并采出固定，最后打开颅腔，检查脑组织（主要样品）后，将之取出用10%中性福尔马林液固定，72 h后取出固定的脑组织，充分水洗，从脑前叶、额叶、枕叶和小脑4个部位横断，各取0．3 cm厚的脑组织，经过脱水、透明、石蜡包埋等步骤，最后用Leica组织切片机切成5 μm厚的切片待染色。

1．3 普通染色 普通染色方法即苏木素－伊红染色（HE），试验所用的是梅野氏HE染色法，切片经脱蜡水合后，用梅野氏苏木素染色7 min，蓝化，再用85%乙醇伊红染色5 min，然后脱水、透明和封片。

1．4 改良革兰氏染色 草酸铵结晶紫和碘溶液是按照常规配制的，将蕃红液替换为80%酒精伊红染色液。染色的操作步骤为:先用溶液性蜡笔在水合的切片周围画1个圈，滴加草酸铵结晶紫溶液，染色15 min。流水冲洗，再滴加碘溶液，染色10 min;流水冲洗，用95%酒精脱色，再用蒸馏水洗涤，最后用80%酒精伊红染1 min，并梯度脱水、透明和封片。

1．5 甲基绿派诺宁染色 染色液由甲液和乙液混合而成。甲液的组成为:5%派诺宁水溶液6 ml，2%甲基绿水溶液6 ml，蒸馏水16 ml混合而成。乙液为1 mol/L醋酸盐缓冲液（pH=4．8），其组成为:6%冰醋酸 40 ml，13．6%醋酸钠 60 ml混合即为pH 4．8（最好用酸度仪测试）的醋酸盐缓冲液。将甲液和乙液分别置于4℃冰箱中备用。染色前取甲液6 ml和乙液16 ml充分混匀即为染色液。乙液在7 d内有效，最好用前现配。

染色的操作很简单，将染色液滴加在组织上，染色15 min后，吸去多余染液，滴加蒸溜水漂洗2次，充分洗去未结合的染液，再脱水、透明和封片。

2 结果与分析

2．1 临床症状 5只病兔均具有典型的脑炎原虫性神经症状。站立时，病兔的头部歪斜，全身肌肉间歇性痉挛。运动时，病兔共济失调，呈现转圈运动（图1A）。病重的兔子，运动时常出现以身体长度为轴的翻滚。其中1例病兔的头部已倒侧于地面，眼球震颤，伴有明显的溶晶状体性葡萄膜炎（图1B）。虽然病兔的运动异常，但食欲正常，采食量没有明显减少。

2．2 普通染色结果 脑组织的切片经HE染色后，在脑组织中检出不同形态的肉芽肿。新形成的肉芽肿主要是以上皮样细胞为主组成的细胞性肉芽肿，病程较长时则伴着肉芽组织的增生形成增生性肉芽肿，病情严重的肉芽肿则为坏死性肉芽肿，即增生性肉芽肿中心的上皮样细胞坏死，即细胞核浓缩、破碎，结构均质红染（图2A）。虽然这些肉芽肿的结构形态明显，但在HE染色的情况下均未检出兔脑炎原虫。

2．3 改良革兰氏染色结果 在细胞性肉芽肿和增生性肉 芽肿的上皮样细胞的胞浆中可检出大量染成蓝色的兔脑炎原虫。虫体较小，但数量较多，呈多形态散在或形成纳虫泡，位于上皮样细胞的胞浆（图2B）。在坏死性肉芽肿的坏死组织中，可见脑炎原虫释出于细胞外。存在于坏死组织内的兔脑炎原虫，虫体较大，呈蓝色，聚体成团块或散在（图2C）。

2．4 甲基绿派诺宁染色 派诺宁对于增殖期的脑炎原虫具有良好的染色作用。在细胞性肉芽肿和增生性肉芽肿的上皮样细胞的胞浆中，可检出大量染成红色或紫红色的兔脑炎原虫。虫体的形态多样，大多呈圆形或椭圆形，也有的呈逗点状或短杆状（图2D）。在坏死性肉芽肿的坏死组织中，也能检出呈红色的兔脑炎原虫。

3 讨论

3．1 病原诊断的重要性 众所周知，兔脑炎原虫虽然可感染多种动物及人类，但大多为隐性感染，并无明显的临床症状。在自然情况下，家兔感染脑炎原虫后，当病情发展到一定的阶段时才出现以神经症状为主的临床表现。大量研究表明，神经症状并非兔脑炎原虫病所特有的症状，所以在临床上进行诊断时必须将其与其他能引起相似神经症状的疾病（如巴氏杆菌病、内耳炎、中耳炎和耳螨病等）相鉴别［11－12］。一般认为，常用的血清学对脑炎原虫的特异性抗体检测技术（如间接荧光抗体技术（IFAT）和ELISA等）虽然很敏感，也很确实，但由于许多临床上健康的家兔也可检出中等或高滴度的脑炎原虫特异性抗体，所以血清学特异性抗体的检出仅能证明该家兔曾感染过脑炎原虫，但不能最终确诊。如果血清学检查为阴性反应，一般可排除脑炎原虫的感染。大多数学者认为，对兔脑炎原虫病的确诊是一种综合性诊断，如果能从具有神经症状病兔的脑组织，发现特异性肉芽肿，并通过特殊染色而检出脑炎原虫，即可确诊［9，13］。临床上确诊也需要在血清学检查呈阳性的基础上从尿沉渣中检出兔脑炎原虫。因此，从病理组织切片或排泌物的样品中检出虫体对兔脑炎原虫病的确诊是非常重要的。

3．2 改良革兰氏染色后的特点 革兰氏染色是检查和鉴别细菌最常用的方法之一，主要是通过涂片来检查。一般认为，革兰氏染色呈阳性反应的细菌，是因其细胞壁上具有肽聚糖。后者能形成一种网状分子，当用乙醇脱色时肽聚糖网孔缩小，从而保留了结晶紫碘复合物在细胞壁上，再用蕃红染色时不再着色，而呈现蓝色。反之，革兰氏阴性菌由于细胞壁上没有肽聚糖，所以不能保留结晶紫－碘复合物，而被蕃红染成红色。在对病理组织切片的染色过程中，染色的切片必须用酒精进行脱水处理，而革兰色染色液中的蕃红经酒精处理时严重脱色，以致切片变成无色，从而难以观察和确认病原。该研究根据革兰氏染色的基本原理，发现用蕃红对组织切片，主要起到调色、制造反差作用，故将蕃红染液换成酒精伊红染液，从而取得了良好的染色效果。另外，在涂片上进行革兰氏染色时用时很短，染色效果却很好，但在病理切片上用相同的时间，组织却不被染色。适当延长染色时间后，不仅使组织着色，而且使兔脑炎原虫清楚可辨。

3．3 哌诺宁染色的特异性 大量研究表明，脑炎原虫在细胞内的增殖速度很快，常有大量新生的孢子分散在寄主的细胞内或形成纳虫泡。据报道，脑炎原虫的细胞器并不发达，比如线粒体和高尔基复合体的结构并不存在，而是有执行其相应功能的酶类［14－16］。因此，在孢子的分裂增殖过程中常有大量mRNA和核糖体产生，从而增加了孢子内的RNA总量。用甲基绿派诺宁染色时，甲基绿易和聚合程度高的DNA结合，使之染成绿色。派诺宁可选择性地与聚合程度较低的RNA结合，使之染成红色。由于兔脑炎原虫的核较小，DNA含量低且高度紧密聚合［14］，故体积很小，被甲基绿染色的比例较小。当孢子原浆中的mRNA和核糖体增多时，被派诺宁染色的数量增多，占孢子胞浆的比例增大，所以孢子常被染成红色或紫红色。因此，用派诺宁染色能使脑炎原虫良好地着色，达到鉴别虫体的目的。

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