壮骨镇痛胶囊对裸鼠乳腺癌移植瘤模型整合素αvβ3表达的影响

曹建雄，冯志威，何迎春，毕四丽，王文美，何丹，柳景红（.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙40007；.湖南中医药大学，湖南长沙4008；3.湖南中医药大学第一附属医院骨伤科，湖南长沙40007）

壮骨镇痛胶囊对裸鼠乳腺癌移植瘤模型整合素αvβ3表达的影响

曹建雄1，冯志威2，何迎春2，毕四丽2，王文美2，何丹2，柳景红3*
（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007；2.湖南中医药大学，湖南长沙410208；3.湖南中医药大学第一附属医院骨伤科，湖南长沙410007）

目的研究壮骨镇痛胶囊对裸鼠乳腺癌骨转移整合素αvβ3表达的影响。方法将32只裸鼠接种乳腺癌细胞后，再随机分为壮骨镇痛胶囊预防组（下称预防组）、壮骨镇痛胶囊治疗组（下称治疗组）、氯磷酸二钠胶囊对照组（下称对照组）和模型组，每组各8只，分别予以上述相应药物干预，测定各组的抑瘤率，将移植瘤分离后进行切片，HE染色，并用光镜观察其病理形态，采用免疫组化方法检测移植瘤组织细胞黏附迁移相关的整合素αvβ3表达。结果预防组抑瘤率最高，与其他各组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组和对照组抑瘤率相当，两者比较（P＞0.05）。与模型组比较，各组整合素αvβ3表达差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组与对照组比较（P＞0.05），而预防组αvβ3表达显著低于治疗组及对照组（P＜0.05）。结论壮骨镇痛胶囊能抑制裸鼠乳腺癌移植瘤的生长，其作用机制可能与移植瘤组织整合素αvβ3表达有关，预防组的效应比治疗组效应强。

裸鼠乳腺癌；骨转移；壮骨镇痛胶囊；整合素αvβ3；裸鼠

〔Abstract〕Objective To study the effect of Zhuanggu Zhentong capsule on the expression of integrin-αVβ3 in nude mice with breast cancer metastatic tumor bone metastasis.Methods 32 nude mice inoculated with breast cancer cells were randomly divided into the prevention group of Zhentong Zhuanggu capsule（prevention group），the treatment of Zhentong Zhuanggucapsule（treatmentgroup），thecontrolgroupofClodronatecapsule（controlgroup）andthemodelgroup. Each group had eight nude mice and was with the drug intervention.The inhibition rate of tumor was determined，the metastatic tumor was spilt，and the pathological feature was observed by light microscope after HE staining.The expressionsofintegrin-αVβ3inadhesionmigrationrelativelyofmetastatictumortissuecellsweredetectedby immunohistochemical method.Result Compared with other groups，the inhibition rate of tumor in prevention group was the highest，the difference was statistically significant（P＜0.05）.The inhibition rate of tumor of in treatment group and control group was almost at the same（P＞0.05）.Compared with the model group，the differences of integrin-αVβ3 expression in the other groups had statistically significant（P＜0.05）；the treatment group was compared with the control group（P＞0.05），while the αVβ3 expression in the prevention group was lower than that in prevention group and control group（P＜0.05）. ConclusionZhuangguZhentongcapsulecouldrestrainthegrowthofnudemousebreastcancermetastatictumor. The mechanism of action might be related to the expression of integrin-αVβ3 of metastatic tumor tissue，the effect ofprevention group was better than the treatment group.

〔Keywords〕naked mouse breast cancer；bone metastasis；Zhuanggu Zhentong capsule；integrin-αVβ3；nude mouse

乳腺癌最常见的远处转移部位之一是骨骼，约占晚期乳腺癌患者的70%［1］，骨转移临床表现中最主要的特点是出现顽固性疼痛，并出现进行性加重，同时伴随系列并发症，比如骨质疏松、病理性骨折等。整合素家族是一类异二聚体跨膜糖蛋白，这种糖蛋白是由一个α亚单位和一个β亚单位组成的，这两种亚单位按照不同的组合构成20余种整合素。它主要介导细胞和细胞基质之间的相互黏附和信号传导，在体内广泛表达。其中，整合素αvβ3参与许多类型肿瘤的血管生成、侵袭、转移，对于引起乳腺癌的骨转移起到极为重要的作用。前期研究表明，壮骨镇痛胶囊的功效包括控制或缩小骨转移病灶，减少骨相关事件。本实验旨在从分子水平研究经壮骨镇痛胶囊干预后，裸鼠乳腺癌移植瘤模型中整合素αvβ3表达活性的变化，探讨壮骨镇痛胶囊防治乳腺癌骨转移的作用机制。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1动物BALB/c裸小鼠，体质量（18±3）g，SPF级，雌性，购自湖南中医药大学动物实验中心，动物合格许可证号：SCXK（湘）2009-0004，SPF级动物房饲养。高温高压消毒饲料及垫料，自由喂养，塑料瓶自由饮用消毒的自来水。饲料及实验室均由湖南中医药大学实验动物中心提供。

1.1.2细胞株人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231，购于中南大学湘雅医学院现代实验中心细胞库。

1.1.3药物制备（1）壮骨镇痛胶囊由湖南中医药大学第一附属医院药剂科制备，药物组成：淫羊藿、补骨脂、骨碎补、桑寄生、穿山甲、黄芪、党参、三七、鸡血藤、延胡索、威灵仙、制南星、制地龙、全蝎、蜈蚣、陈皮、甘草，生产批号20101018，规格：0.45 g× 24粒/瓶。取壮骨镇痛胶囊0.45 g，先将胶囊去壳，内容物用10 mL无菌生理盐水溶散摇匀，制成0.045 g/mL药液，4℃保存。（2）氯磷酸二钠胶囊药液的制备拜耳医药保健有限公司生产，国药准字J20120040，规格400 mg×60粒/盒。将抗骨转移药物氯磷酸二钠胶囊0.8 g溶于10 mL生理盐水中，制成0.08 g/mL备用，4℃保存。

1.1.4试剂RPMI-1640培养基由北京鼎国昌盛生物技术公司生产；胰蛋白酶粉由北京中杉生物技术公司生产；新生小牛血清由杭州四季青公司提供；二甲基亚砜（DMSO）由北京鼎国公司提供；青霉素、链霉素由大连美罗制药厂生产；H2O2内源性酶灭活剂由武汉博士德公司提供；即用型SABC免疫组化试剂盒（产品货号：SA1050）、兔抗鼠ITG泰斯特公司生产。

1.1.5主要仪器AE31型倒置显微镜及Motic Med 6.0数码医学图像分析系统均由Motic公司生产；GB204型电子天平由瑞士梅特勒公司生产；80-2型离心机由上海手术器械厂生产。

1.2方法

1.2.1造模与分组MDA-MB-231是一种人乳腺癌细胞株，将其培养于含15%新生小牛血清的RPMI-1640培养液的培养瓶中，并进行细胞传代。等到乳腺癌细胞长满培养瓶，先使用D-Hank’s液洗涤之后，再以0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液将其消化，从中取出少许RPMI-1640培养液，并将其吹打成细胞悬液，同时将乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞制成细胞悬液于裸小鼠前腋皮下接种，根据文献方法［2-3］（裸鼠左心室注射MDA-MB-231BO细胞法造模），建立了人乳腺癌皮下移植瘤模型。再将32只裸鼠按随机数字表法分成4组，分别是：模型组、壮骨镇痛胶囊预防组（下称预防组）、壮骨镇痛胶囊治疗组（下称治疗组）以及氯磷酸二钠胶囊对照组（下称对照组）。

1.2.2给药方法各组动物都在SPF级动物房中自由饮水、摄食，保持自然光照预适应1周，并接种乳腺癌细胞悬浊液。预防组在接种乳腺癌细胞后次日开始应用壮骨镇痛胶囊浓缩液灌胃，其他各组待裸鼠乳腺癌移植瘤体积达到约5 mm3时（见1.3.1）计算移植瘤体积，以0.2 mL蒸馏水给模型组的鼠灌胃；裸鼠灌药量按照人的等效剂量进行换算，即：小鼠灌胃剂量（g/kg）=等效系数×成人剂量（g）/成人体质量（60 kg）。预防组、治疗组以壮骨镇痛胶囊浓缩液0.5 g/（kg·d）灌胃；对照组以氯磷酸二钠胶囊浓缩液0.2 g/（kg·d）灌胃；3组灌胃频率均为每日2次，持续30 d后，采用断颈法处死各组动物，分离移植瘤，并分别切取标本制片。

1.3指标检测

1.3.1移植瘤体积测定V=a×b2π/6（V为肿瘤体积，a为肿瘤长径，b为肿瘤短径）。各组在接种乳腺癌细胞后次日开始检查，每隔一天测定一次移植瘤体积。

1.3.2抑瘤率计算实验结束时，完整剥取移植瘤组织，电子天平准确测量瘤体组织质量，按照公式计算，抑瘤率=（模型组平均瘤体质量-治疗组平均瘤体质量）/模型组平均瘤体质量×100%。

1.3.3移植瘤组织HE染色及病理形态学观察将移植瘤标本分离后，从中切取小部分，并将其固定于中性甲醛。之后取出组织块，通过常规水洗、脱水、透明、浸蜡4个过程后以石蜡包埋，将蜡块放置于切片机中，5 μm连续切片并展开，捞片贴附于载玻片上，以室温保存，HE染色，光镜观察。

1.3.4整合素αvβ3的检测将移植瘤标本分离后，切取小部分标本以多聚甲醛固定，经过梯度乙醇逐级脱水，透明，石蜡包埋，切片，切片厚度大约为5 μm，酒精脱蜡，PBS冲洗3次；3%过氧化氢室温孵育10 min，PBS冲洗3次，滴加5%BSA封闭液1 -2滴，盖满组织片，室温孵育20 min，甩去多余液体，不洗；取配好的一抗工作液50～100 μL覆盖组织，4℃过夜；取过夜片，PBS冲洗3次；滴加生物素标记二抗，室温孵育15 min；再以PBS冲洗3次；滴加试剂SABC 1～2滴，室温孵育20 min；以PBS冲洗4次；拭去组织周围多余残留液，加50～100 μL DAB显色液盖满组织片，孵育20 min；至PBS工作液中冲洗3次；以苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。按试剂盒要求操作。采用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统分析并测定阳性产物的光密度值作为αvβ3表达活性。

1.4统计学分析

2　结果

2.1各组裸鼠瘤体质量及抑瘤率变化比较

与模型组比较，预防组、治疗组、对照组瘤体质量均显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。预防组瘤体质量低于治疗组和对照组（P＜0.05），抑瘤率高于另两组（P＜0.05）。对照组与治疗组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2各组移植瘤病理形态学比较

模型组的细胞排列密集甚至重叠。细胞之间界限不清，细胞质少，细胞核呈圆形或椭圆形的泡状，大核仁位于中央部位；治疗组细胞则呈固缩状态，细胞核通常染色质增多，核呈多形性，细胞内可见角化，偶见角化珠形成；对照组细胞呈固缩状态，有细胞间桥和/或角化物，具有典型的不规则巢状，细胞多形性及复层排列；预防组细胞固缩，密度增加，轮廓变形，与周围细胞分离染色质变致密，着边。见图1（封三彩图）。

2.3各组移植瘤组织整合素αvβ3表达的比较

与模型组比较，各组αvβ3表达差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组与对照组比较（P＞0.05），而预防组αvβ3表达显著低于治疗组及对照组（P＜0.05）。见表2及图2（封三彩图）。

表1　各组药物对裸鼠乳腺癌移植瘤的抑瘤作用比较（±s，n=8）

表1　各组药物对裸鼠乳腺癌移植瘤的抑瘤作用比较（±s，n=8）

注：与模型组比较△P＜0.05；与预防组比较▲P＜0.05。下表同。

组别模型组预防组治疗组对照组瘤体质量（g）0.898±0.046 0.387±0.046△0.570±0.044△▲0.583±0.032△▲抑瘤率（%）—56.84 36.49▲35.45▲

表2　各组裸鼠移植瘤整合素αvβ3表达的比较（±s，%）

表2　各组裸鼠移植瘤整合素αvβ3表达的比较（±s，%）

组别模型组预防组治疗组对照组n8888 αvβ3 28.65±5.21 10.25±3.37△15.15±2.03△▲15.90±4.56△▲

3　讨论

乳腺癌骨转移（骨瘤）的病因病机有两方面：一方面为久病或久用行气活血、祛痰化毒之品，使肾虚不能生髓养骨，不荣则痛；另一方面为乳岩之毒乘虚深陷经髓骨骼，气血痰浊瘀毒闭阻经络，致不通则痛。壮骨镇痛胶囊以中医学“肾主骨生髓”的理论为指导，骨碎补为君药，补肾强筋壮骨，活血散瘀止痛，标本兼顾；仙灵脾、补骨脂、桑寄生助君药补肾生髓，三七粉、莪术、延胡索、威灵仙、穿山甲散结通络、消肿定痛，为臣药；以生黄芪补虚托毒，使攻不伤正；再以制南星化痰散结，陈皮理气健脾和中，酒白芍柔肝缓急止痛，皆为佐药；顽痹邪气久羁，又以制地龙、全蝎、蜈蚣攻毒散结、搜剔止痛；地龙之寒能制约诸药之温燥太过，并能引药力达病所，甘草补脾益气，调和诸药亦具佐使之用。诸药合用，使肾虚得补，筋骨得荣、痰气瘀毒结聚得化、血活络通、疼痛得止。

整合素αvβ3能够通过特有的途径转导信号，调节细胞的各种生物学功能。整合素αvβ3具有参与细胞与细胞外基质一系列结合反应的作用。在原发乳腺癌细胞、侵袭性乳腺癌细胞以及骨转移灶的肿瘤细胞中整合素αvβ3的表达均呈阳性［4］。整合素αvβ3在破骨细胞中也大量表达，同时在破骨细胞介导的溶骨性骨转移过程中发挥着至关重要的作用。整合素αvβ3能与骨组织中的骨桥蛋白和骨唾液蛋白等细胞外基质蛋白发生结合反应，介导乳腺癌细胞与骨小梁发生黏附［5］，从而导致乳腺癌骨转移发生。

通过本项研究得出，预防组裸鼠平均瘤体质量明显低于另外3组裸鼠，抑瘤率也高于另外2组裸鼠。病理形态观察上，治疗组细胞呈固缩，细胞有角化的趋势。预防组细胞固缩，密度增加，轮廓变形。结果表明，壮骨镇痛胶囊具有明显抑制肿瘤生长并减小瘤体的作用。

既往研究证实［6-9］，壮骨镇痛胶囊能壮骨镇痛、控制或缩小骨转移病灶，减少骨相关事件，同时已从体外实验证实壮骨镇痛胶囊能显著抑制乳腺癌细胞的迁移、黏附、增殖等。而乳腺癌骨转移发生的关键因素是肿瘤细胞和骨基质的黏附，肿瘤细胞转移的基本因素是骨唾液蛋白的浸润能力。在骨细胞、骨转移的肿瘤细胞上的整合素αvβ3上存在着骨唾液蛋白的结合位点，通过二者结合效应，在肿瘤细胞黏附、浸润和转移中发挥重要作用。

壮骨镇痛胶囊对乳腺癌移植瘤骨转移具有一定的防治作用，该胶囊对于裸鼠乳腺癌移植瘤组织中整合素αvβ3的表达起到显著抑制作用，通过抑制裸鼠乳腺癌移植瘤组织中整合素αvβ3的表达，抑制裸鼠乳腺癌移植瘤细胞黏附、浸润效应，从而达到防治乳腺癌骨转移的作用。但其具体的作用机制，尚待进一步研究。

［1］Mundy GR.Metastasis to bone：causes，consequences and therapeutic opportunities［J］.Nat Rev Cancer，2002，2（8）：584-593.

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［3］程旭峰，刘胜.放射性核素骨显像支持下建立乳腺癌骨转移裸鼠模型［J］.中华实验外科杂志，2011，28（9）：1 588-1 590.

［4］WongNC，MuellerBM，BarbasCF，etal.Alphavintegrinsmediateadhesionandmigrationofbreastcarcinoma cell lines［J］.Clin Exp Metastasis，1998：2301-2 330.

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［6］柳景红，何迎春，曹建雄，等.壮骨镇痛胶囊对乳腺癌细胞体外增殖和迁移的抑制效应研究［J］.湖南中医药大学学报，2009，29（6）：22-25.

［7］何迎春，柳景红，曹建雄，等.壮骨镇痛胶囊对乳腺癌nm23-H1和c-myc基因表达的影响［J］.临床肿瘤学杂志，2010，15（9）：774-778.

［8］柳景红，何迎春，曹建雄，等.壮骨镇痛胶囊对乳腺癌细胞迁移运信号通路关键蛋白P-JNK和Rac-1表达的影响［J］.中华中医药学刊，2010，28（4）：802-804.

［9］柳景红，冯智成，曹建雄，等.壮骨镇痛胶囊对裸鼠乳腺癌移植瘤模型骨转移指标ITG-αvβ3及BSP的影响［J］.中医药导报，2012，18 （9）：88-90.

（本文编辑徐爱良）

Effect of Zhuanggu Zhentong Capsule on the Expression of Integrin-αVβ3 in Breast Cancer Transplantable Tumor Naked Mouse Models

CAO Jianxiong1，FENG Zhiwei2，HE Yingchun2，BI Sili2，WANG Wenmei2，HE Dan2，LIU Jinghong3*
（1.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410007，China；2.Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410007，China；3.Department of Orthopedics and Traumatology，the First Affiliated Hospital of HUCM，Hunan，Changsha 410007，China）

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2015.02.005.014.04

2014-06-09

湖南省自然科学基金项目资助（13JJ3103）；湖南省科技厅项目资助（2007TP4021）；湖南省科技厅项目资助（2010TT2020）；湖南省教育厅基金项目资助（09C724）。

曹建雄，男，博士，主任医生，研究方向：中西医结合防治肿瘤病。

*柳景红，男，主任医师，教授，E-mail：2274674521@qq.com。