基于高通量测序的内蒙古姆州诺尔盐湖细菌群落组成分析

杨　丽, 殷婷婷, 尹　馨，顾笑赫, 温洪宇

(江苏师范大学生命科学学院，江苏 徐州　221116)

基于高通量测序的内蒙古姆州诺尔盐湖细菌群落组成分析

杨丽, 殷婷婷, 尹馨，顾笑赫, 温洪宇

(江苏师范大学生命科学学院，江苏 徐州221116)

从内蒙古姆州(多罗)诺尔盐湖采集卤水样品，提取总DNA后对其细菌16S rRNA基因进行 PCR扩增，通过454高通量测序，得到优化序列9903条，共分入1325个OTU中。优化序列经筛选后得到8320个序列，分别归入细菌13个门，其中变形菌门(Proteobacteria)占主要地位，占总序列数的39.39%；其次32.08%的序列归入拟杆菌门(Bacteroidetes)。在纲水平上，所得序列分别属于Cytophagia，γ-变形菌纲(Gamma-proteobacteria)，α-变形菌纲(Alpha-proteobacteria)和浮霉菌纲(Phycisphaerae)。属水平上的数据表明，所得序列属于硝化球菌属(Nitrococcus)、嗜盐单胞菌属(Halomonas)、海杆菌属(Marinobacter)、Gracilimonas、盐厌氧菌属(Halanaerobium)、弧菌属(Salinivibrio)和Salinibacter等。研究揭示了姆州诺尔盐湖嗜盐细菌群落组成，表明姆州诺尔盐湖存在丰富的嗜盐细菌资源和潜在的新类群，从而为新种的挖掘及嗜盐菌的开发提供了理论数据。

细菌；454高通量测序；细菌群落；盐湖；16S rRNA

我国是个多盐湖国家，现约有1000个盐湖，主要分布于内蒙古、新疆、西藏、青海及其周边地区[1]，其中内蒙古盐湖数量且分布范围较广。盐湖作为高盐浓度特殊环境，其中富含嗜盐微生物。嗜盐细菌是盐湖生态系统中的重要组成部分，同时具有特殊的遗传机制和特有的代谢产物，因此具有很大的应用研究价值与开发前景[2～4]。据统计，内蒙古自治区共有169个干涸或半干涸盐湖[5]，针对其盐湖逐渐减少的现状，加快该地区对盐湖嗜盐微生物类群的研究具有重要意义。

尽管越来越多的嗜盐菌被分离出来，但自然环境中仅有1%左右甚至更少的微生物具有可培养性[6]。因此仅仅依靠传统的纯培养技术对环境微生物进行研究，已满足不了微生物资源开发和利用的发展[7]。454焦磷酸测序等高通量测序技术,又被称为第二代高通量测序技术，可以克服传统方法在克隆测序方面的局限，具有分析结果准确、高灵敏度、快速和高自动化的特点[4]，已被应用于大量研究中[8～11]。姆州诺尔盐湖，位于内蒙古自治区东北部的呼伦贝尔市新巴尔虎左旗，在阿木古郎镇西部。湖盆为新生代河谷侵蚀凹地或风蚀低地，湖区依靠大气降水与地下水补给。该湖属硫酸盐型硫酸亚钠型，盐类资源有石盐和芒硝两大类且以石盐为主，当地牧民捞取石盐加工食用；与普通淡水湖及海水相比，该湖NaCl浓度极高，为63.16g/L[12]，盐浓度适宜极端嗜盐微生物的生长[13]，生态环境特殊。但是目前尚未见关于内蒙古盐湖细菌群落的报道，因此本文运用454焦磷酸测序方法,研究姆州诺尔盐湖嗜盐细菌群落组成，以期为新种的发现和嗜盐菌的开发提供理论依据。

1　材料与方法

1.1采样、DNA提取及16S rRNA扩增

于2014年8月采集姆州诺尔盐湖卤水样品1000mL，用0.22μm灭菌滤膜过滤。膜剪切后，使用 OMEGA 公司 E.Z.N.A Water DNA 试剂盒抽提基因组DNA。采用引物为27F(5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′)和533R(5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC -3′)[14]进行PCR扩增。PCR 20μL反应体系： 5 × FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mMdNTPs 2 μL，正向引物(5 μM) 0.8 μL，反向引物(5 μM) 0.8 μL，FastPfu聚合酶0.4 μL，模板DNA 10ng，最后补 ddH2O 至20μL。

1.2高通量测序

将PCR 产物文库使用Promega公司的Quanti FluorTM-ST 蓝色荧光定量系统进行检测。按照测序量需要确定相应比例进行混合，于454/Roche GS-FLX平台进行测序，测序使用GS FLX +Sequencing Method Manual_XL R70Kit试剂盒。

1.3序列优化与物种组成分析

去除所测有效序列末端接头序列、后引物序列、多碱基N、polyA/T与低质量序列、标签序列和前引物序列，得到最终优化序列。与SILVA库中16S核糖体序列数据库进行比对，以16S rRNA基因序列相似度低于97%作为不同的分类单元(OTU)为标准，使用mothur软件进行OTU聚类分析，并构建稀疏曲线。根据SILVA数据库中的参考序列对OTU进行种属鉴定和分类学分析。

2　结果与讨论

2.1454测序序列数据

对姆州诺尔盐湖卤水样品进行454高通量测序，统计分析得出细菌有效序列数为13034条，通过序列优化后所得的优化序列数为9903条，占有效序列的75.98%，最终优化序列平均长度为474bp。

2.2细菌丰度

对所有序列按照97%的相似度进行 OTU 划分并进行生物信息统计分析得出，本样品所测得序列共归入272个OTU中。在97%相似性水平下划分 OTU并制作的本样品的稀疏曲线(图1)可以看出，在所测序列数量增大的情况下，所归类的OTU数量逐渐增大，但增大的趋势减小，说明测序质量较好，深度较大。

图1　稀疏曲线Fig.1　Rarefaction curves

2.3细菌群落组成

2.3.1细菌在门水平上的群落组成

在门水平上，优化序列经筛选后所得的8320个序列分别归入13个门中。由图2可知，变形菌门(Proteobacteria)是样品中最主要的门类，共有3277条序列，占总数的39.39%；其次2669条序列属于拟杆菌门(Bacteroidetes)，占总数的32.08%；有1354条序列并未进行分类到门，或并未发现，占总数的16.27%；其余稀有的门类占总数的4.23%(图2)。

图2　细菌群落在门水平上的分布统计Fig.2　Relative abundance in different phyla of the bacteria

2.3.2细菌在纲水平上的群落组成

在纲水平上，所得序列分别属于Cytophagia，γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)，α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)，浮霉菌纲(Phycisphaerae)，数量分别为2334、2230、627和423，分别占总序列数的28.05%、26.8%、7.54%、5.08%(图3)。其中，有1907条序列并未进行分类到纲，或并未发现，占序列总数的22.92%(图3)。

图3　细菌群落序列在纲水平的上分布统计Fig.3　Relative abundance in different classes of the bacteria

2.3.3细菌在属水平上的群落组成

属水平上的数据表明，共有6431条序列为未知序列或尚未被分类到属，占总序列数的77.3%，说明有很多潜在新种待发现；其他主要有690、220、155、113、101、89和79条序列分别属于硝化球菌属(Nitrococcus)、嗜盐单胞菌属(Halomonas)、海杆菌属(Marinobacter)、Gracilimonas、盐厌氧菌属(Halanaerobium)和弧菌属(Salinivibrio)，分别占总序列数的8.29%、2.64%、1.86%、1.36%、1.21%和1.07%，其余稀有属共521条序列，占序列总数6.27%(下表)。

表　细菌群落序列在属水平的上分布统计

3　结果与讨论

利用454高通量测序对姆州诺尔盐湖卤水样品进行测序，统计分析得到细菌优化序列为9903条，平均长度为474bp，获得1325个OTU。细菌群落组成分析得知，优化序列经筛选后所得的8320个序列分别归入13个门中，变形菌门(Proteobacteria)是样品中最主要的门类；其次，32.08%属于拟杆菌门(Bacteroidetes)。在纲水平上，所得序列分别属于Cytophagia，γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)，α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)和浮霉菌纲(Phycisphaerae)，分别占总序列数的28.05%、26.8%、7.54%、5.08%。属水平上的数据表明，所得序列属于硝化球菌属(Nitrococcus)、嗜盐单胞菌属(Halomonas)、海杆菌属(Marinobacter)、Gracilimonas、盐厌氧菌属(Halanaerobium)、弧菌属(Salinivibrio)和Salinibacter等，分别占总序列数的8.29%、2.64%、1.86%、1.36%、1.21%、1.07%和0.95%。

姆州诺尔盐湖中的嗜盐细菌类群与新疆巴里坤湖、玛纳斯湖[15]、罗布泊盐湖[16]和达坂城盐湖[17]比较，共有的菌群仅有嗜盐单胞菌属(Halomonas)，且均为其优势菌群，说明嗜盐单胞菌属(Halomonas)分布较广，并且对不同的高盐环境都具有很强的适应能力,反映出不同地区盐湖中嗜盐细菌的群落组成结构具有一定的相似性。但新疆盐湖中另两个共同的优势菌群喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)与芽孢杆菌属(Bacillus)在姆州诺尔盐湖中并未发现，且姆州诺尔盐湖中还有一些独特的类群，包括硝化球菌属(Nitrococcus) 与海杆菌属(Marinobacter)等。这些菌群在关于嗜盐微生物的文献中未见报道，较为独特，也说明了姆州诺尔盐湖生态环境的独特性。姆州诺尔盐湖与何敏艳等报道的连云港台北盐土及三圩盐土细菌群落[18]比较发现，三地共有的属为嗜盐单胞菌属(Halomonas)，而三圩盐土中还有两种姆州诺尔盐湖与台北盐土中并未发现的属，即喜盐芽孢杆菌(Halobacillus)和Pontibacillus。姆州诺尔盐湖盐浓度极高，为6.316%，台北盐场盐田土为2.172%，而三圩盐场盐土盐浓度为0.813%。由嗜盐微生物划分标准[14]可知，姆州诺尔盐湖盐浓度极高，适宜生长极端嗜盐菌，而其盐浓度对于中度嗜盐菌等并非最适条件。有关喜盐芽孢杆菌(Halobacillus)和Pontibacillus的研究[19～22]表明，其种主要属于中度嗜盐菌，因此并未在姆州诺尔盐湖此高盐环境下检测到此两种菌群。另外，姆州诺尔盐湖样品在各分类水平上均有大量序列属于未知序列或未被分类的序列，对应有可能为一些潜在的新种，因此此地区盐湖的微生物物种资源具有很大的挖掘价值。要进一步完善和改进分离培养等技术对其进行研究，才能获得更全面的信息。

本文通过高通量测序获得了大量的序列，全面解析了内蒙古姆州诺尔盐湖中细菌的群落结构，可为今后盐湖细菌群落多样性和物种分布特征的比较提供一定的理论基础，也可为补充完善我国的高盐环境中微生物物种资源及今后的嗜盐菌的开发提供重要的参考。

致谢：高通量测序由上海美吉生物公司完成，特此致谢。

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Analysis on the Bacterial Community Composition of Muzhou Nuoer Salt Lake in Inner Mongolia based on High-throughput Sequencing

YANG Li,YIN Ting-ting,GU Xiao-he,WEN Hong-yu

(SchoolofLifeSciences,JiangsuNormalUniversity,Xuzhou,Jiangsu221116,China)

Brine samples were taken from Muzhou Nuoer salt lake in Inner Mongolia, after extracting total DNA, 16S rRNA gene of the bacteria was amplified by PCR, and 454 high-throughput sequencing were used for the investigation of bacterial communities and species diversity of Muzhou Nuoer salt lake in Inner Mongolia. A total of 9903 valid reads were obtained from the brine sample, and 8320 trimmed reads were remained after trimming. 1325 operational taxonomic units (OTUs) were generated. The bacterial community in the sample was dominated by the Proteobacteria(39.39%) and Bacteroidetes(32.08%) in phylum level. The bacterial community in the sample was dominated by the Cytophagia, Gamma- proteobacteria, Alpha-proteobacteria and Phycisphaerae in class level. In genus level, the bacterial community in the sample was dominated by the Nitrococcus, Halomonas, Marinobacter, Gracilimonas, Halanaerobium, Salinivibrio and Salinibacter. The study revealed the community composition of halophilic bacteria in Muzhou Nuoer salt lake, indicating that there are abundant halobacteria resources and new species in the Muzhou Nuoer salt lake. Thus, this study could provide theoretical data for the exploration and development of new species in the future.

Bacteria; 454 pyrosequencing; bacterial community; salt lake; 16S rDNA

2015-04-22

国家级大学生实践创新训练计划要项目(2013103200 38)。

杨丽(1991-)，女，山西忻州人，2014年毕业于江苏师范大学生物科学专业，主要从事环境微生物研究工作。

温洪宇，wenhy2007@126.com。

X835

A

1001-3644(2015)06-0034-05