浅析CRISPR/CAS系统诱导的哺乳动物细胞基因组突变及相关检测方法比较

罗云超 王琳

(西北农林科技大学 陕西咸阳 712100)

生物学领域已经逐渐进入后基因组的时代,其目的是通过对新基因的功能进行高通量筛选并分析,从而阐明某些基因在人体的生长发育以及疾病的发生发展过程中的重要功能[1]。基因组编辑方法能对基因组遗传物质进行准确的定位,并进行稳定改造,从而为生物学领域的疑难问题提供有效的解决方案[2]。

1 CRISPR/CAS系统诱导

使用Cas9系统,在人293T细胞的打靶载体构建基础上,对相关基因实行定点的敲除,检测打靶效率。

2 检测方法

2.1 Surveyor检测

(1)培养转染过细胞,筛选阳性克隆,扩大培养以对细胞DNA进行提取。

(2)通过设计好的引物扩增目的基因,并扩增未突变的野生型细胞基因。

(3)测定PCR产物浓度,并浓缩至终浓度约为20ng/ml,且使两份样品等量。

(4)均匀混合150ng wt与150ng待测样品,放置PCR仪中杂交退火。

(5)在混合样品中加入1ml的Enhancer S、lml的Nuclease S和0.15M MgCl2。

(6)将上述混合液置于42℃放置3h后,加入lml的Stop Solution中止反应。

(7)计算突变效率。

2.2 AFLP检测

(1)培养转染过细胞,筛选阳性克隆扩大培养以对细胞DNA进行提取。

(2)通过设计好引物扩增目的基因,得到目的片段,纯化回收胶,并进行浓度测定。

(3)用限制性内切酶PvuII酶切回收后的PCR片段。

(4)37℃,2h后中止反应,检测琼脂糖。

(5)计算突变效率。

2.3 HRM检测

(1)在目的片段靶位点两端,通过Beacon Designer软件设计一段200bp左右的引物。

(2)培养转染过的细胞,筛选阳性克隆扩大培养以对细胞DNA进行提取。

(3)通过Light Cycler 480II定量PCR系统,定量PCR扩增。

(4)按比例加入Roche Dye染料,配制PCR体系,定量PCR扩增。

(5)计算突变效率。

3 数据的统计学处理分析

采用SPSS18.0软件处理研究结果,采用c2检验进行统计学分析,P＜0.05时说明两者间差异具有统计学意义。

4 结果与分析

CRISPR/CAS系统诱导的哺乳动物细胞基因组突变率为40%。另外,在三种检测方法中,Surveyor检测IL2RG基因的平均打靶效率为(20.5±1.5)%,AFLP检测为(10.2±2.4)%,而HRM检测为(41.4±5.4)%。HRM检测最佳,Surveyor检测次之,而AFLP检测最差,两两间差异性具有统计学意义(P＜0.05)。

5 讨论

基因组编辑不仅定位准确,同时也能够使染色体遗传物质进行稳定的改造[3]。该技术方法对于生物遗传物质的修改是一种较为理想的方式,不论是在基础研究领域还是在实际应用研究领域均具有广阔的应用广阔的应用前景和价值。基因编辑技术能够使人们按照自己的设想对遗传物质进行改造,有利于稳定遗传模型的建立,同时也为疑难杂症等问题提供了更加有效的解决办法。通过使用基因编辑技术,人类创造除了更加完美的品种,利用该技术使人们对相关疾病发生的分子机制有了更准确的认识,有利于难治性疾病的治疗提供了有力的科学理论依据,技术促使人们探索生命科学本质的可能性[4]。

通过本文研究结果,CRISPR/CAS系统打靶效果显著,操作简单,具有较高识别效率。HRM检测效率很高,是一种良好突变检测方法。

[1]Cong L,Ran FA, Cox D,Lin SL,Barretto R,Habib N,Hsu PD,Wu XB,Jiang WY,Marraffini LA,Zhang F.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.Science,2013,339(6121):819-823.

[2]Wang HY,Yang H,Shivalila CS,Dawlaty MM,Cheng AW,Zhang F,Jaenisch R.One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.Cell,2013,153(4):910-918.

[3]Garneau JE,Dupuis M ,Villion M,Romero DA,Barrangou R,Boyaval P,Fremaux C,Horvath P,Magadán AH,Moineau S.The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature,2011,468(7320):67-71.

[4]Feng ZY,Zhang BT,Ding WN,Liu XD,Yang DL,Wei PL,Cao FQ, Zhu SH,Zhang F,Mao YF,Zhu JK.Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system.Cell Res,2013,23(10):1229-1232.