P47phox基因第4外显子多态性与湖南省汉族人群脑梗死的相关研究*

黄晓松，罗银利，谭李红，陈媛

（1.湖南省第二人民医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学 研究生教育学院，湖南 长沙 410007）

P47phox基因第4外显子多态性与湖南省汉族人群脑梗死的相关研究*

黄晓松1，罗银利1，谭李红1，陈媛2

（1.湖南省第二人民医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学 研究生教育学院，湖南 长沙 410007）

目的探讨P47phox基因第4外显子G338A（Arg90His）和G457A（Thr129Thr）多态性与湖南省汉族人群脑梗死的相关性。方法采用PCR-单链构象多态技术和DNA直接测序法检测湖南省汉族人群散发性脑梗死患者110例、10个脑梗死家系成员110例及100例健康对照组的P47phox基因第4外显子G338A和G457A多态性。酶法测定总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），免疫比浊法测定apoA-I及apoB100，ELISA法测定Lp（a）血清水平。结果p47phox基因第4外显子G338A多态存在GG、GA和AA 3种基因型，脑梗死组及其各亚型组G338A多态A等位基因频率分布与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）；G457A多态存在GG和GA两种基因型，脑梗死组及其各亚型组G457A多态基因频率分布与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；脑梗死组及其各亚型组血清TC、TG、LDL-c及Lp（a）水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；组内不同基因型间血脂、脂蛋白水平与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论p47phox基因G338A多态A等位基因可能是脑梗死，特别是有高血压病性和糖尿病性脑梗死患者的一个危险因素；G457A多态可能与脑梗死的发病无关。p47phox基因G338A 和G457A多态性与血脂代谢可能有关。

脑梗死；P47phox；第4外显子；基因多态性；血脂

缺血性脑卒中已成为严重威胁人类健康的常见病和多发病，遗传因素在其发病过程中发挥着重要的作用［1］。P47phox是NAD（P）H氧化酶一个重要的亚基，在诱导NAD（P）H氧化酶活化，产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）的过程中发挥重要作用［2］，而活性氧是缺血性脑卒中、高血压等血管性疾病发病的危险因素［3-8］。P47phox基因的编码区存在多种遗传多态位点，其中位于第4外显子的G338A （Arg90His）和G457A（Thr129Thr）多态性与ROS的产生密切相关。本研究采用PCR-单链构象多态技术和DNA直接测序法检测湖南省汉族散发性脑梗死患者、脑梗死家系成员及正常人群的P47phox基因第4外显子G338A和G457A多态性，从而探讨其与脑梗死的相关性及对血脂代谢的影响。

1　资料与方法

1.1研究对象

1.1.1正常对照组选取无血缘关系的正常健康人共100例。其中男54例，女46例；最大年龄75岁，最小年龄21岁，平均（56.3±13.2）岁。均为湖南省第二人民医院健康体检人员，病史询问无脑卒中家族史，无肝、肾、血液病、自身免疫性疾病和甲状腺病史。

1.1.2散发性脑梗死组选取无家族聚集现象的散发性脑梗死患者共110例。男63例，女47例，最大年龄86岁，最小年龄32岁，平均（57.2±13.5）岁。其中脑血栓形成组（cerebral thrombosis，CT）及腔隙性脑梗死组（lacunar infarction，LI）分别为77例和33例；有高血压的脑梗死组（HBP+CI）及无高血压的脑梗死组（非HBP+CI）分别为78和32例；有糖尿病的脑梗死组（DM+CI）及无糖尿病的脑梗死组（非DM+CI）分别为10和100例。均为湖南省第二人民医院神经内科2012年6月-2014年1月住院和门诊患者。所有病例均符合1995年全国第4次脑血管疾病学术会议修订的诊断标准［9］，经头颅CT或MRI确诊。不包括心源性、动脉炎、外伤、血液病、药物、肿瘤、脑血管畸形或动脉瘤等引起的脑卒中；排除患有严重肝肾疾病、甲状腺疾病、血液病和最近3个月服用雌激素患者，近2周均未服用降血脂药和抗凝药。

1.1.3脑梗死家系组收集10个脑梗死家系共包括成员110例。先证者为湖南省第二人民医院神经内科2012年6月-2014年1月住院和门诊，其中，男61例，女49例，最大年龄78岁，最小年龄15岁，平均（55.4±12.6）岁。其中患病者42例，未患病者68例。

1.2方法

①人基因组DNA样品的制备：抽取研究对象外周静脉血4 ml，肝素抗凝，用常规酚/氯仿抽提法提取DNA。②P47phox基因型检测：扩增P47phox基因第4外显子的引物经Primer Premier 5.0软件设计，所得引物序列为：正向引物：5'-TCCCAAGTGGTTTGACG G-3'；反向引物:5'-CCTCCTCTTTCTGGCTGTG-3'。反应在PE4800型PCR仪上进行，反应条件为：94℃预变性5 min，93℃变性40 s，56℃复性30 s，72℃延伸1 min，30个循环后，72℃充分延伸10 min，反应管冷却至4℃。③单链构象多态分析：取4μl PCR产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测产物，如特异性好，则将PCR产物加等量2×变性载样缓冲液，混合后95℃变性10 min，然后立即置冰上5 min，取8μl上样于含5%甘油的8%49∶1的中性聚丙烯酰胺凝胶中，160 V电压4℃电泳10 h，电泳结束后采用银染法染色并拍照。选取中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中有异常泳带的阳性样本进行正反向测序。测序结果在GenBank和SNP数据库中进行比较分析。④血脂和脂蛋白的测定：采用氧化酶法测定三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）；免疫比浊法测定载脂蛋白A-I （apoA-I）及载脂蛋白B100（apoB100）；ELISA法测定血清脂蛋白a［Lp（a）］水平。

1.3统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，所有资料在Dbase软件中建立数据库，等位基因频率=（2×纯合子+杂合子）/（2×受检人数），基因型频率和等位基因频率的差异用χ2检验或有关校正方法。按Hardy-Weinberg平衡法检验样本的群体代表性。组间血脂比较用t检验，不同基因型亚组间血脂比较用ANOVA方差分析及LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1脑梗死组和对照组的临床特点

脑梗死组、脑梗死家系组两组中有高血压病史、糖尿病病史者高于对照组（P＜0.01），脑梗死组和脑梗死家系组间差异无统计学意义（P＞0.05）；3组在年龄、性别构成、体重指数、吸烟及饮酒史差异无统计学意义（P＞0.05）（见表1）。

表1　脑梗死组和对照组临床资料比较

图1　G338A（Arg90His）GG基因型反向测序图 （箭头所指）

图2　G338A（Arg90His）GA基因型反向测序图 （箭头所指）

图3　G338A（Arg90His）AA基因型反向测序图（箭头所指）

2.2P47phox基因第4外显子G338A多态性分析P47phox基因第4外显子G338A有3种不同的电泳图谱，经测序后证实分别为GG，GA和AA 3种基因型（见图1～3）。

2.3 P47phox基因第4外显子G457A多态性分析

P47phox基因第4外显子G457A有两种不同的电泳图谱，经测序后证实分别为GG和GA两种基因型（见图4～5）。

2.4 P47phox基因G338A多态分布

脑梗死组与对照组基因型及等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡检验（P＞0.05）。脑梗死组及其各亚型组、脑梗死家系组中患病与未患病与对照组G338A多态A等位基因频率分布比较，差异均有统计学意义（P＜0.01），见表2。

2.5P47phox基因G457A多态分布

脑梗死组与对照组基因型及等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡检验（P＞0.05）。脑梗死组及其两组各自亚型组与对照组G457A多态基因频率分布比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

图4　G457A（Thr129Thr）GG基因型反向测序图（箭头所指）

图5　G457A（Thr129Thr）GA基因型反向测序图（箭头所指）

表2　脑梗死组亚型间p47phox基因4号外显子G338A（Arg90His）多态分布

2.6 P47phox基因G338A和G457A多态对血脂、脂蛋白水平的影响脑梗死组血清TC、TG、LDL-C及Lp（a）水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；组内不同基因型间血脂、脂蛋白水平与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4～5。

表3　脑梗死组亚型间p47phox基因4号外显子G457A（Thr129Thr）多态分布

表4　脑梗死组p47phox基因G338A（Arg90His）不同等位基因对血脂和脂蛋白水平的影响 （x±s）

表5　脑梗死组p47phox基因G457A（Thr129Thr）多态不同等位基因对血脂和脂蛋白水平的影响 （x±s）

3　讨论

NADPH氧化酶即尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，又称还原型辅酶Ⅱ氧化酶，其由催化亚基gp91phox，跨膜亚基p22phox，胞浆亚基p47phox、p67phox、p40phox、小G蛋白Rac和RaplA等组成的酶复合体。研究发现［10］，NADPH氧化酶可能是体内生成ROS的主要酶体。当细胞受到刺激后，细胞质亚基p47phox转位至胞膜，与膜上亚基结合激活NADPH氧化酶［11］，激活后的NADPH氧化酶经过系列反应产生ROS。可见，ROS的产生过程p47phox发挥了始动功能［12］。p47phox即吞噬细胞氧化酶47千道尔顿蛋白质，又名嗜中性粒细胞胞质因子1（neutrophil cytosol factor 1，NCF-1），其功能区由5个功能域组成，翻译产物是一个长度为399个氨基酸的片段［13］。目前研究发现，ROS可刺激内皮细胞释放血管细胞黏附分子（vas cularcell adhesion molecule-1，VCAM-1）、单核细胞趋化因子（mon-ocyte chemoattractant protein，MCP-1）等细胞因子，使单核细胞向血管壁聚集，形成泡沫细胞，反过来泡沫细胞又可以释放氧和过氧化氢。另外，中等量的ROS产物可作为细胞内的第2信使，通过激活血管平滑肌细胞与生长相关的信号传导系统引起血管平滑机细胞的增生；并通过调节平滑肌基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和基质金属蛋白酶-9 （MMP-9）的活性，参与血管重塑及引起斑块破裂［14-16］，因此它与血管性疾病的发生有密切关系。也有研究发现活性氧与缺血性卒中、动脉粥样硬化的形成、高血压、高脂血症、糖尿病等疾病密切相关，是血管性疾病的危险因素［3-8］。可见，p47phox与高血压病、动脉粥样硬化形成和缺血性卒中等血管性疾病和糖尿病、高脂血症密切相关。若编码NAD（P）H氧化酶亚单位的基因多态性或基因突变使ROS生成增加，就可能通过直接氧化作用和间接作为第2信使参与信号转导加速动脉粥样硬化形成、高血压病、糖尿病和高脂血症的发生与发展，从而使其对脑卒中的易感性增加。

P47phox在ROS产生过程中的功能PX区和两个SH-3区密切相关，而第 4号外显子上 G338A （Arg90His）、G457A（Thr129Thr）多态是其中的多态位点。本研究结果显示，在中国湖南省汉族人群中G338A（Arg90His）多态位点有GG，GA和AA 3种基因型；G457A（Thr129Thr）多态位点有GG、GA两种基因型，未发现AA基因型。目前该两个多态位点在不同人种的分布情况国内外尚未见报道，并且G457A（Thr129Thr）为首次发现的新多态位点。在研究P47phox第4外显子多态位点与湖南汉族人群脑梗死相关性中发现，脑梗死组及其各亚型组、脑梗死家系中患病组与未患病组G338A多态A等位基因频率分布与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。脑梗死组及其各亚型组、脑梗死家系中患病组与未患病组G457A多态基因频率分布与对照组比较，其差异无统计学意义（P＞0.05）。以上结果提示p47phox基因G338A多态A等位基因可能是脑梗死，尤其是有高血压病的、有糖尿病的脑梗死患者的一个危险因素；P47phox基因G457A多态性可能与脑梗死无关。另外发现，脑梗死组及其各亚型组血清TC、TG、LDL-C及Lp（a）水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；组内不同基因型间血脂、脂蛋白水平与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。可见，湖南省汉族人群P47phox基因第4号外显子多态性可能与血脂代谢有关。

笔者推测可能是 P47phox基因第4号外显子G338A多态A等位基因的表达，导致338位点密码子突变（G→A），发生非同义突变，将精氨酸置换为组氨酸，从而引起脑梗死患者P47phox分子结构改变，导致活性氧的产生功能增强，产生过多的活性氧。过多的ROS通过直接氧化作用和间接作为第2信使参与信号传递加速动脉粥样硬化形成、高血压病和糖尿病的发生与发展，从而使其对脑梗死的易感性增加。P47phox基因第4号外显子G457A多态表达，457位点密码子突变（G→A），发生同义突变，导致相应的457位氨基酸由苏氨酸置换为苏氨酸，可能引起脑梗死患者P47phox分子结构改变，但对NAD（P）H氧化酶产生ROS的功能可能无影响，也许与本研究的种群和方法有关，其确切机制尚需进一步研究。

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（张蕾 编辑）

Relationship between polymorphisms of p47phoxgene exon 4 and cerebral infarction in Hunan Han population*

Xiao-song HUANG1，Yin-li LUO1，Li-hong TAN1，Yuan CHEN2
（1.The Second People's Hospital of Hunan Province，Changsha，Hunan 410007，P.R.China；2.School of Graduate Education，Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410007，P.R.China）

【Objective】To investigate the relationship between polymorphisms of G338A（Arg90His）and G457A（Thr129Thr）of p47phoxgene exon 4 and cerebral infarction（CI）in Hunan Han population.【Methods】The G338A and G457A polymorphisms of p47phoxgene exon 4 in 110 patients with cerebral infarction（CI），100 sex-and age-matched healthy controls and 10 CI pedigrees from Hunan Han population were determined by PCR-single strand conformation polymorphism analysis and DNA sequencing.TC，TG，HDL-C and LDL-C levels were tested using enzymatic method；apoA-I and apoB100 were measured with immunoturbidimetry；and plasma lipoprotein（a）［Lp（a）］level was measured by ELISA.【Results】Three gene types GG，GA and AA were found in the G338A polymorphism site of p47phoxgene exon 4.Statistically significant differences were found in the frequencies of A allele of G338A polymorphism between the CI groups and the control group（P＜0.01）.Two gene types GG and GA were found in the G457A polymorphism site of p47phoxgene exon 4.No statistically significant differences were found in the frequencies of genotypes and alleles of G457A polymor－phism between the CI groups and the control group（P＞0.05）.The serum levels of TC，TG，LDL-C and Lp（a）of the CI groups were markedly higher than those of the control group（P＜0.01）.【Conclusions】An allele in G338A polymorphism of p47phoxgene exon 4 may be one of the risk factors of CI patients，especially the CI patients accompanied with hypertension or diabetes.The gene G457A is probably not related with the onset of CI.TheG338AandG457Apolymorphismsofp47phoxgeneareprobablyassociatedwithplasmalipid metabolism.

cerebral infarction；p47phox；exon 4；gene polymorphism；plasma lipid

R743.33

A

1005-8982（2015）33-0020-07

2015-06-26

湖南省卫生厅资助课题（No：B2010-086）

谭李红，E-mail：tanlihong118@163.com