解卷积定量核磁共振法测定黄芪注射液中8种初生代谢成分

陈燕燕等

摘要 应用质子核磁共振技术（1HNMR）结合解卷积的峰提取方法，建立了中药黄芪注射液中氨基酸、有机酸类和糖类等8种初生代谢成分的含量检测方法。注射液样品经冷冻干燥后精密称取10 mg，加入0.6 mL D2O（含内标TSP 0.02 g/mL）用于NMR测试。根据1HNMR指纹谱，从黄芪注射液中鉴定出20种初生和4种次生代谢成分。应用解卷积法提取乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸8种初生代谢成分的定量峰，然后进行峰面积积分，并采用内标法计算各个成分的含量。在给定浓度范围内，8种成分呈现良好的线性相关（R2>0.9990），精密度 RSD<3.8%，重现性RSD<2.7%，稳定性RSD<4.5%，回收率为91.4%～102.7%。结果表明，与常规处理方法相比，解卷积检峰再积分的方法可降低复杂体系中质子信号峰的重叠度，获得更加精确的定量峰积分面积，从而进一步提高1HNMR含量分析的准确度。采用本方法对5个厂家共20批黄芪注射液样品中的8种初生代谢成分进行了含量测定，并运用主成分分析法对不同厂家的样品进行了聚类和区分。

关键词；定量核磁共振法； 解卷积； 黄芪注射液； 初生代谢成分

1引言

随着仪器的发展，质子核磁共振（Nuclear magnetic resonance，1HNMR）技术目前已逐渐应用于药物分析领域，其特点在于可同时提供化合物结构确证的定性信息和含量测定的定量信息，因此分析过程无需待测物对照品，且样品预处理步骤简单、专属性强、不破坏样品 [1～5]。1HNMR常用定量方法为绝对内标定量法，即以含量已知的内标物与待测物制成混合溶液同时测定图谱，通过二者峰面积的比值确定待测物的含量[6]。在对混合物中的各个成分进行定量分析时，其关键在于每个成分定量峰的选择，通常选择完全独立、无干扰的特征质子信号峰进行含量测定。将1HNMR指纹图谱技术引入中药注射液的化学成分表征中所面临的难题是： 1HNMR谱的化学位移值范围通常比较窄（δ 0～12），在该区间内质子信号峰相互重叠严重，不易寻找到完全独立的信号峰用于多成分的含量测定。

解卷积（Global spectral deconvolution，GSD）是一种1HNMR图谱处理方法，可通过对全谱反褶积的精确校正鉴别复杂峰形，从复杂质子信号中分离出重叠的信号峰。1HNMR谱在有杂质峰、信号重叠和信噪比不高的情况下，可以使用解卷积提取定量峰计算积分面积确定化合物的浓度[7]。近来，已有相关报道运用GSD分析方法对混合物进行定量测定[8]。

黄芪注射液，益气养元，扶正祛邪，养心通脉，健脾利湿。作为临床常用药物用于心气虚损、血脉瘀阻之病毒性心肌炎、心功能不全及脾虚湿困之肝炎等症状，目前共有14家国内药企获批生产。中国药典和卫生部颁布标准中黄芪药材和黄芪注射液的定量指标成分均为黄芪甲苷[9，10]，并采用高效液相色谱（High performance liquid chromatography，HPLC）法对其进行检测。在前期研究中发现，黄芪药材中还存在大量氨基酸、有机酸、糖类化合物等初生代谢成分[11]，但由于其极性较大，是常规反相HPLC方法的检测盲点。本研究进一步运用质子核磁共振（1HNMR）法对黄芪注射液中的化学成分进行表征，并应用定量1HNMR技术和解卷积处理方法对黄芪注射液中的多种初生代谢成分进行含量测定。本研究将解卷积法引入中药混合体系进行含量测定，并测定了5个厂家20批次的黄芪注射液样品，比较了不同厂家样品中初生代谢成分的含量差异。

2实验部分

2.1仪器与试剂

BRUKER AVANCEⅢ600型超导核磁共振波谱仪，质子激发频率600.23 MHz，配置BBFO正相观察宽带探头和BVT3200数字控温仪（瑞士Bruker公司）； 5 mm标准核磁样品管（美国Norell公司）； D2O（氘代度>99.8%， 美国SigmaAldrich公司）； 3（三甲基甲硅烷）丙酸d4钠盐（TSP）氘代度>98%（美国SigmaAldrich公司）； 实验用黄芪注射液为市售产品，规格为每支装10 mL，5个厂家共20批黄芪注射液，分别为QCB（1311102）、ZB（A20120709，A20130206）、SW（131001D2，130324D1，130803D2，130525D2，131116D3，130326D1，130313D2）、DL（1301072，1307222，1309212）、XY（1304023，1310022，1304011，1310031，1310103，1305081，1310072）。

2.21HNMR测试条件

采用zg30脉冲序列测定样品溶液的1HNMR图谱。测定温度298 K，观测频率600.23 MHz，谱宽12019.2 Hz， 90°脉冲宽度13 μs，采样数据点65536，扫描次数16次，延迟时间15 s，接受增益128。用TSP信号定标。

2.3样品的制备

取黄芪注射液样品于

Symbolm@@ 80℃冰箱中迅速冷冻，再将其放入真空冷冻干燥箱中冻干后精密称取10 mg， 加入0.6 mL D2O（含内标TSP 0.02 g/mL），转移至5 mm核磁管中，加封直接用于1HNMR测试。

2.4方法学考察实验

2.4.1标准曲线称取8种标准品（乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸），置于2 mL容量瓶中，用含有TSP的D2O稀释到刻度，摇匀，倍比稀释得到5个不同浓度的标准液，各取0.6 mL置于核磁管中，测定1HNMR图谱，记录各个标准品定量峰的积分面积，计算标准曲线。

2.4.2精密度和重复性取同一份黄芪注射液供试品溶液，在上述2.2项下条件下连续测定6次，记录定量峰积分面积，计算精密度（RSD值）。取同一批次黄芪注射液供试品溶液6份，上述2.2项下条件下进行测定，记录定量峰积分面积，计算重复性（RSD值）。

2.4.3稳定性取同一份黄芪注射液供试品溶液，分别在0， 2， 4， 6， 8， 12和24 h进样测定，记录积分面积，记录定量峰积分面积，计算RSD值。

2.4.4加样回收率称取同一批次黄芪注射液供试品5 mg，共6份； 然后分别称取乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸8种标准品5 mg，溶解、稀释到浓度分别为0.08960， 0.9858， 0.4674， 0.2693， 0.4579， 0.3551， 0.0870和0.0289 mg/mL，取混合标准600 μL加入6份供试品中，在上述2.2项下条件下进行测定，记录积分面积，计算回收率。

3结果与讨论

3.11HNMR指纹谱分析

黄芪注射液样品的1HNMR指纹谱（图1）质子信号峰分布在δ 0～9.5 之间，其中δ 0.0～3.2 是氨基酸和有机酸质子信号区，δ 3.2～5.5 是糖基质子信号区，δ 5.5～9.5为黄酮类质子信号区

根据质子信号峰的化学位移值和偶合裂分情况，并结合二维核磁相关信息，共鉴定出24种化学成分，其中包括4种次生代谢成分： 毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮7 OβD吡喃葡萄糖、芒柄花素、2′羟基3′，4′二甲氧基异黄烷7 OβD吡喃葡萄糖； 20种初生代谢成分： 7种氨基酸（亮氨酸、苏氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、焦谷氨酸、甘氨酸），5种有机酸（乳酸、乙酸、琥珀酸、丙二酸、甲酸），6种糖（葡萄糖、甘露醇、蔗糖、果糖、蜜三糖、阿拉伯糖），乙醇和甜菜碱。质子信号的详细归属见表1。

紫色代表实验峰形（Purple： experimental peak shape）； 绿色代表解卷积处理法的峰形（green： The peak shape of GSD processing）。

面积进行比较，计算8种成分的含量。

3.3方法学考察结果

方法学考察结果见表2，普通峰提取积分定量核磁法的乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸8种初生代谢成分线性相关系数（R2）为0.9763～0.9990，精密度RSD为1.6%～4.6%，稳定性RSD为0.75%～8.6%，重复性RSD为0.94%～4.6%，加样回收率的范围为80.7%～98.1%。

综合比较实验结果（表2和表3）显示， 解卷积定量核磁法的线性、精密度、稳定性、重复性总体优于普通峰提取积分定量核磁法，尤其对质子信号峰重叠度较高的脯氨酸和焦谷氨酸，以及端基质子信号峰距水峰较近的葡萄糖和蔗糖的含量测定准确度改善显著。

3.4样品测定

采用解卷积1HNMR定量分析法测定5个厂家20批次的黄芪注射液中8种初生代谢成分（乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸）的含量。结果参见表4。

3.5模式识别分析

5个厂家20批黄芪注射液样品的NMR数据（每批n=3），采用主成分分析（Principal components analysis，PCA）法对60个样品进行无监督的模式识别分析。PCA碎石图显示： 主成分PC1和PC2的累积解释变量超过90%（图3A）； 得分图显示： 5个厂家黄芪注射液样品具有明显的聚类和分组效果（图3B）。图4进一步显示： 乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸8种初生代谢成分在5个厂家样品中含量水平差异显著。上述实验结果表明： 8种初生代谢成分对区分不同厂家的黄芪注射液产品也具有重要作用。

4结 论

本实验通过质子核磁共振指纹谱检测并鉴定出黄芪注射液中24种成分，其中20种为初生代谢成分，根据黄芪注射液的工艺＼[10＼]推测其中的乙醇可能来源于药材提取过程中使用的溶剂，而其他19种初生代谢成分均为黄芪药材中的化学成分。分别采用普通峰提取和解卷积峰提取的定量核磁法，对乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸8种初生代谢成分的含量进行分析，方法学考察结果显示： 对于重叠度较高的质子信号峰，以及巨大溶剂峰信号旁边的样品质子信号峰，解卷积定量核磁法可有效改善其含量测试的准确度。应用该方法对5个厂家20批黄芪注射液样品中8种初生成分进行定量分析，结合PCA模式识别法成功区分了不同厂家的黄芪注射液产品。结果显示： 正大青春宝药业样品中除焦谷氨酸外，其他都趋于中等水平； 大理药业样品中氨基酸、有机酸和糖类成分的浓度相对偏低； 上海新亚药业样品中蔗糖的浓度较低，其他氨基酸和有机酸成分较其他厂家高。上述研究提示： 除黄芪甲苷、毛蕊异黄酮等指标成分，氨基酸、有机酸、糖类等初生代谢成分受不同厂家药材来源、生产工艺影响也较大，是区分不同厂家黄芪注射液产品的重要指标。

References

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11CHEN YanYan， LI XiaoNan WANG YueFei， JIANG MiaoMiao. China Science Paper， 2014， 12（9）： 1410-1413

陈燕燕， 李晓男， 王跃飞， 姜苗苗. 中国科技论文， 2014， 12（9）： 1410-1413

AbstractTo establish the quantification method for 8 primary metabolites （amino acids， organic acids and carbohydrates） in Huangqi Injection， proton magnetic resonance （1H NMR） technique was employed based on processing approach of global spectral deconvolution （GSD）. About 10 mg of each sample was precisely weighed after freezedrying， and then directly dissolved in D2O for NMR analysis. 20 primary metabolites and 4 secondary metabolites were detected and identified in the same 1H NMR spectrum. Among them， 8 primary metabolites （acetate， proline， pyoglutamate， malonate， glycine， glucose， sucrose， formate） were selected to determine the contents using an internal standard method. In the given concentration ranges， it showed a good linear correlation for 8 components （R2>0.9990） ， with the RSD of precision lower than 3.8%， the RSD of repeatability lower than 2.7%， the RSD of stability lower than 4.5%， and the recovery rate between 91.40%-102.7%. The results indicated more accurately integral areas could be obtained by GSD processing compared to the ordinary method， which further improved the accuracy of content analysis. 1H NMR method based on GSD was successfully used to determine the levels of 8 primary metabolites in Huangqi Injection samples of 20 batches from 5 manufacturers. The score plots of PCA also showed the samples from different manufacturers clustered and classified well.

KeywordsProton magnetic resonance； Deconvolution； Huangqi Injection ； Primary metabolites

（Received 23 January 2015； accepted 7 April 2015）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.81303181）

第八届科学仪器网络原创作品大奖赛征集合作期刊邀请函

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2、征稿范围

共设立色谱、质谱、光谱及X射线、材料测试、食品检测、药物分析、环境监测、实验室建设及采购、综合类九个赛区。

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