均匀设计法优化人类SMN基因PCR扩增

高春艳

摘要：采用均匀设计法，对影响PCR的主要因素，即退火温度、引物、Taq酶、二甲基亚砜（DMSO）、模板DNA进行了优化，得到人类SMN基因的最优PCR扩增体系。结果表明，PCR扩增条件和反应体系的最优组合为：退火温度61.6 ℃、Taq酶0.26 μL、引物（10 μmol/L）3.6 μL、DMSO（100%） 2 μL、DNA 3.8 μL。

关键词：DNA；盐析法；均匀设计法；灰度分析；PCR扩增

中图分类号：Q781 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）12-3031-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.061

Optimizing the PCR Amplification of Human SMN Gene by Uniform Design Method

GAO Chun-yan1a，1b，LI Jun1a，1b，CAI Lu1a，1b，2

（1a.The Institute of Bioengineering and Technology；1b.School of Mathematics Physics and Biological Engineering，

Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014010， Inner Mongolia， China；

2.Inner Mongolia Key Laboratory of Biomass-Energy Conversion， Baotou 014010， Inner Mongolia， China）

Abstract： Based on uniform design method， the critical factors implicating with PCR， such as annealing temperature， primer，Taq polymerase，DMSO，DNA，were optimized respectively and PCR amplifying condition of human SMN gene was established. The results shouwed that annealing temperature 61.6 ℃，Taq polymerase 0.26 μL， primer（10 μmol/L）3.6 μL，DMSO（100%）2 μL，DNA3.8 μL were designated to the optimized combination between PCR amplifying condition and reaction system.

Key words： DNA； salting out method； uniform design； gray analysis； PCR amplification

人类SMN基因位于染色体5q13上，全长约20 kb，含9个外显子，该染色体上有两个高度同源的拷贝，端粒侧拷贝（SMN1或SMNt）和着丝粒侧拷贝（SMN2或SMNc）。SMN1和SMN2在序列上高度相似，两者之间的DNA序列仅存在5个碱基的差异，其中SMN2基因外显子7（+6C→T）的碱基置换直接影响了基因的可变剪接模式，因此对SMN基因的研究具有重大的现实意义。人类SMN基因片段为高GC含量，富含GC碱基的DNA的PCR难点在于模板DNA形成的二级结构使DNA模板比较难变性[6]；退火时引物与模板不能很好地结合，容易形成错配；延伸过程也不能很好进行，从而使扩增效率大大降低；普通的PCR扩增1.5 kb以上的长片段基因经常会遇到困难[7]。均匀设计法[8，9]将试验有关因素的各水平数均匀分散在试验范围内，使每一个试验点具有更好的代表性，减少了试验次数，而且试验结果可用计算机处理，在寻找最佳试验条件、最佳配比等方面是选择优化条件的有力工具。本研究采用均匀设计法对PCR主要因素：退火温度、引物、Taq酶、DMSO（二甲基亚砜）、DNA等5个因素进行优化试验，从而得到适合于人类基因SMN基因片段的PCR扩增条件和反应体系的获得最优组合。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 人类外周血标本取自包头医学院第一附属医院；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，上游引物P1：5′-CGACGACAAGACCGTGAATGAAAAT GAAAGCCAAGT-3′，下游引物P2：5′-GAGGAGAAGAGCCGTGATAGTACGACCGA CGGA-3′；Taq酶、dNTPs、DMSO购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.2 仪器 NanoDrop紫外分光光度计，G16-W型微量高速离心机，Eppendorf高速冷冻离心机，Biometra PCR扩增仪，TGL-16C型台式离心机，GeneGenius凝胶成像仪。

1.2 方法

1.2.1 盐析法从人类外周血中提取人类全基因组DNA 取500 μL血样，置于1.5 mL EP管中，加入1 000 μL 0.9%的NaCl，摇匀后静置5 min，10 000 r/min离心20 min；弃上清，加入1 000 μL红细胞裂解液，充分颠混均匀至清亮，然后10 000 r/min离心10 min；弃上清，沉淀中加入1 500 μL红细胞裂解液，充分振荡后12 000 r/min离心10 min；彻底弃上清，加入白细胞裂解液500 μL（裂解细胞）涡旋混匀；再加入150 μL的饱和NaCl涡旋混匀，静置15 min后12 000 r/min离心15 min；取上清置于另一EP管中，加预冷的无水乙醇至1.5 mL，轻轻摇匀后，有白色絮状物（DNA）析出，用移液枪将溶液吸出，将絮状物留在EP管中；用移液枪吸取500 μL的75% 乙醇轻轻冲洗EP管中的DNA，加入50 μL 1×TE Buffer，使DNA溶解，将溶液状态的DNA置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 均匀设计法优化PCR扩增条件 在确定的反应程序下研究退火温度、Taq酶、引物（10 μmol/L）、DMSO、DNA浓度5个因素对SMN基因片段扩增结果的影响（反应体系中其他因子为定量）。根据均匀设计法的要求，将每个因素分成10个水平根据均匀设计进行试验，组合见表1。

1.2.3 PCR产物灰度分析 按均匀设计法优化PCR扩增条件（表1），得到的PCR产物进行0.8%琼脂凝胶电泳后，并用Quantity one 4.6.2进行灰度分析。

2 结果与分析

2.1 盐析法DNA提取结果

由图1可以看出，盐析法提取的DNA在琼脂糖凝胶电泳上条带清晰整齐，具有较好的完整性。

2.2 优化前的PCR扩增结果

由图2可以看出，优化前的PCR扩增产物的凝胶成像图可见条带不是很清晰，说明优化前的PCR扩增效果不好，需要进行进一步优化。

2.3 均匀设计法优化PCR扩增结果

将提取的DNA中浓度最好的作为DNA样品，并按照表1中的条件进行PCR扩增，其产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像结果如图3。根据表1中PCR扩增具体条件进行PCR扩增，与图2相比图3的扩增产物的凝胶成像图条带明显清亮、齐整，充分说明均匀设计法优化PCR扩增效果明显。

以泳带灰度值作为指标，用均匀设计软件对PCR扩增条件再次进行优化，得出最终优化条件，结果见表2。

根据表2均匀设计软件的优化结果建立PCR体系，进行PCR扩增，作6个平行管，对其产物进行凝胶电泳，结果如图4。

用均匀设计软件最终优化出的PCR条件进行扩增后的产物的灰度高，达到了预期的效果，说明均匀设计法最终优化出的PCR扩增条件为最优扩增条件。

3 小结与讨论

PCR扩增是基因研究的关键步骤，虽然PCR扩增操作是简单的，但其影响因素较多，扩增效果很难把握。普通PCR扩增1.5 kb以上的长片段基因经常会遇到困难，如果未找到最佳的扩增条件，可能会扩增得到非特异性条带或者根本扩增不出条带。扩增SMN基因片段GC含量较高，富含GC的DNA模板在常规变性温度（94 ℃）下变性不完全，且单链GC富集区易于自身配对，形成发夹、环等稳定的二级结构。DNA聚合酶在带有稳定二级结构的模板链上难于延伸，使PCR产物的延伸效率大幅下降。虽然提高变性温度可使模板变性完全，但变性温度不能过高，变性时间不能过长，否则会对模板DNA造成损害，导致出现更多脱嘌呤及脱氨基敏感位点，同时会降低DNA聚合酶活性。

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