我国主产区18种鲜橙中糖的HPLC测定研究

葛宝坤，陈旭艳，李淑静

（天津出入境检验检疫局，天津300461）

我国主产区18种鲜橙中糖的HPLC测定研究

葛宝坤，陈旭艳，李淑静*

（天津出入境检验检疫局，天津300461）

采用30%的乙腈水（体积比）为稀释液，建立了样品直接稀释、高效液相色谱（HPLC）分离、示差折光检测器检测（RID）快速测定鲜橙中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的可靠方法。该方法以保留时间（Rt）定性，外标法定量；在0.05 mg/mL～5 mg/mL的浓度范围内，标准曲线有良好的线性关系，相关系数大于0.999 5；样品在5.0、10.0、25.0 g/kg 3个加标水平内的回收率范围为95%～101%（n=10），相对标准偏差小于5.0%；方法的定性检出限（LOD）为0.05 g/kg、定量检出限（LOQ）为0.15 g/kg，该方法具有简便、快速、灵敏的特点。应用本方法对产自四川、云南、湖北、重庆等7个产地的18个不同品种的鲜橙进行了4种糖含量的检测，结果表明4种还原糖含量因品种、产地不同而有差异。

HPLC；RID；鲜橙；糖含量

鲜橙营养丰富，富含各种糖、VC、有机酸等，VC是人体是必须的维生素之一，它有利于提高人体免疫力[1]，防止人体衰老，降低胆固醇等作用[2]；橙汁的品质不仅取决于鲜橙的出汁率、固形物、含糖量等因素，还取决于鲜橙的口感及风味，由于鲜橙中含糖的种类及含量是决定鲜橙风味、甜度、口感和品质的重要因素之一；也为人们更好地选择优质的鲜橙提供依据。因此分析鲜橙中的糖类及含量，建立鲜橙中各种糖类及含量的指纹图谱，对鲜橙的品种、产地尤为重要。液相色谱法同时测定鲜橙中糖含量的方法未见报道，尽管有测定糖的国标方法[3-5]，但该方法均不适用鲜橙样品。目前，测定糖的方法主要有滴定法[6]、液相色谱法[7-11]。本文研究并建立了采用样品直接稀释前处理、HPLC分离、RID检测器检测、一次进样可同时检测鲜橙中的4种糖的方法，获得了满意的结果，也填补了我国鲜橙中4种糖含量测定方法的空白。利用本文研究方法，基本建立起了我国主产区鲜橙中的糖类含量分布信息库，对鲜橙的原产地保护具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 仪器

Waters公司e2695高效液相色谱仪，配2414视差折光检测器；MILLIPORE公司MILLI-Q纯水仪；HITACHI CR22G III型高速离心机。

1.2 试剂

乙腈：色谱纯。

果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖：Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，含量≥99%。

糖混合标准储备液的配制：分别准确称取一定量的上述标准品，用30%的乙腈水溶解、混匀、定容，即为标准储备液，标准使用液是将储备液用流动相稀释至所需要的浓度。

1.3 方法

1.3.1 样液的制备

鲜橙去皮，采用积压方式取出橙汁，混匀，取橙汁1.0 g（精确至0.01 g）于15 mL离心管中，用30%的乙腈水直接稀释定容至10 mL，混匀，4℃、10 000 r/min离心10 min，上清液过0.45 μm滤膜进液相色谱仪分析测定。

1.3.2 高效液相色谱条件

色谱柱：WATERS，ENERGY ANALYSIS NH2，300 mm×3.9 mm，10 μm，或相当者；流动相：乙腈+水= 75%+25%；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测池温度：35℃；进样量：10 μL。

1.3.3 分析测定

根据样液中被测水溶性糖的含量情况，选定峰面积相近的标准工作液，标准工作液和待测样液中水溶性糖的响值均应在工作曲性范围内，对标准工作液和待测样液等体积参插进样测定。在1.3.2的色谱条件下，标准品、鲜橙样品的色谱图和保留时间见图1。

图1色谱条件下标准品色谱图（a）、鲜橙样品色谱图（b）Fig.1LC chromatograms of standard solution

1.4 实际样品检测

对来自四川、云南、湖北、重庆、江西、广西、福建7个产地的冰糖橙、锦橙、血橙、桠橙、伏令夏橙、早金甜橙、伦晚脐橙、耐湿脐橙等18个品种的鲜橙进行了四种糖含量的检测。

2 结果与讨论

2.1 稀释液配比的优化

研究了水、甲醇水、乙腈水直接稀释法对测定结果的影响，研究表明：甲醇水因含有醇羟基对视差折光检测器有较大的吸收而影响测试结果；直接用水稀释不仅会形成较大的水峰，而且水峰还不能与甘油峰完全分开，造成测试结果的偏离；另对乙腈水的配比研究还发现：采用30%的乙腈水直接稀释样品可使水峰较小、4种待测成分分离较高、基线噪音低，因此，本研究优选30%的乙腈水（体积比）为样品直接稀释液。

2.2 方法的标准曲线及线性关系

取一定浓度混合标准溶液，用30%的乙腈水分别稀释成浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.0、5.0 mg/mL，按照本方法色谱条件分析测定，绘制工作曲线，4种成分别在0.05 mg/mL～5.0 mg/mL浓度范围内有良好线性关系，其相关系数均大于0.999 5，结果见表1。

2.3 方法的回收率与精密度

取鲜橙样品1.0 g（精确至0.01 g），按照5.0、10.0、25.0 g/kg 3个加标水平，按本方法进行加标回收试验，并做6个平行样，结果为果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的平均回收率均在95%～101%，精密度均小于5.0%，本方法的稳定性良好，结果见表1。

2.4 方法的测定限

取系列鲜橙样品1.0 g，由高到低依次加入混合标准溶液，按照本方法色谱条件测定样品加标结果，根据信噪比S/N=10为本方法的定量限（LOQ）、S/N=3为本方法的定性限（LOD）计算出方法的最低检测限，四种糖的定性检出限（LOD）为0.05 g/kg、定量检出限（LOQ）为0.15 g/kg。

2.5 方法的抗干扰试验

为了确定方法的抗干扰能力及适用性，分别选取鲜橙及橙汁中常见的苯甲酸、山梨酸、糖精钠、柠檬黄、日落黄、柠檬酸、VC等干扰物，按照本方法条件进行测试，结果显示4种待测组分的色谱峰分离度和重现性均较好，上述干扰成分均不干扰结果测定。

2.6 实际样品测试

来自不同产地的18种鲜橙中4种可溶性糖的含量分别为：果糖含量为1.5%～8.8%、葡萄糖含量为1.4%～8.3%、蔗糖含量为1.1%～9.1%、麦芽糖含量为0.1%～0.6%，见表2。

表1 方法的灵敏度、线性关系及回收率（n=6）Table 1Sensitivities，linearships and recoveries of the method（n=6）

表2 18种鲜橙中可溶性糖含量Table 2Content of glycerol in 18 fresh orange

检测结果数据统计表明，不同产地的鲜橙中4种糖的总含量差异在2.5倍以上，直接反应鲜橙甜度指标的果糖含量高低差别近6倍，因此鲜橙中的糖含量测定及其建立可靠的测试方法，对确保鲜橙的原产地保护、产品质量、真伪鉴别，并建立起我国主产区鲜橙指纹谱图信息库具有重要的意义。

3 结论

本文研究的检测方法4种糖组分在0.05 mg/mL～5.0 mg/mL浓度范围内，有良好的线性关系，相关系数大于0.999 5；样品在5.0、10.0、25.0 g/kg 3个加标水平内的回收率范围为95%～101%，6次测定的相对标准偏差小于5.0%；方法的定性检出限（LOD）为0.05 g/L、定量检出限（LOQ）为0.15 g/L，符合色谱分析的方法要求。对实际样品测试的结果表明，该方法具有操作简单、准确、灵敏、不需要SPE净化柱、试剂消耗少、对环境污染小等特点，便于推广与应用。

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[6]蔡威.食品营养学[M].上海:上海交通大学出版社,200:9

[7]马书民王明泰韩大川,等.液相色谱串联质谱法测定食品中甘露糖醇、麦芽糖、木糖醇、山梨糖醇[J].中国食品添加剂,2011(5): 206-210

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[11]吴基任.HPLC-ELSD测定饮料中果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖的含量[J].热带农业科学,2013,33(6):55-58

Determination of Glycerol in 18 Fresh Orange by High Resolution Liquid Chromatography（HPLC）

GE Bao-kun，CHEN Xu-yan，LI Shu-jing*
（Tianjin Entry-Exit Inspecion and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China）

A method was developed for simultaneous determination of fructose，glucose，sucrose and maltose in fresh orange.The sample was diluted directly by acetonitrile-H2O（30%，v/v），and then analyzed by highperformance liquid chromatography（HPLC）with refractive index detector（RID）.The method for qualitative analysis was based on retention time.And external standard method was used for calculation.Good linear relationship was achieved in the range of 0.05 mg/mL-5 mg/mL for the 4 components with correlation coefficients above 0.999 5.The recoveries of the method ranged from 95%to 101%（n=10）with the relative standard deviations（RSDs）below 5.0%at 3 spiked levels of 5.0，10.0，25.0 g/kg.The limit of detection（LOD）of this method is 0.05 g/kg，while the limit of quantification（LOQ）was 0.15 g/kg.This is a simple，rapid，sensitive method for detection fructose，glucose，sucrose and maltose.18 kinds of oranges from 7 fields（Si Chuan，Yun Nan，Hu Bei，Chongqing et al）were analyzed by the method and the results showed the content of fructose，glucose，sucrose and maltose depended on the varieties and field of orange.

HPLC；RID；fresh orange；glycerol

2014-09-11

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.028

国家质检总局公益性行业科研专项（201310146）

葛宝坤（1968—），男（汉），研究员，本科，研究方向：食品中药物残留及添加剂检测技术。

*通信作者：李淑静，高工，博士。