HPLC法测定多产地松露中游离氨基酸的含量

陈莉，路娟，房碧晗，宗传杰，陈曦

（1.中国医学科学院药用植物研究所，北京100193；2.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江哈尔滨150040；3.佳木斯大学，黑龙江佳木斯154007）

HPLC法测定多产地松露中游离氨基酸的含量

陈莉1，2，路娟1，*，房碧晗1，3，宗传杰1，2，陈曦1，*

（1.中国医学科学院药用植物研究所，北京100193；2.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江哈尔滨150040；3.佳木斯大学，黑龙江佳木斯154007）

建立柱前衍生化HPLC法定量测定8个产地松露中16种游离氨基酸。采用水超声法提取松露中氨基酸，以异硫氰酸苯酯作为衍生化试剂柱前衍生，高效液相色谱法测定不同产地松露中氨基酸的含量。8个产地的松露鲜品中含氨基酸约11种～13种，永仁母松露的氨基酸最高，含量6.17%。本方法简便、快速、可靠。松露中氨基酸种类齐全，含量丰富，具有很好的开发利用价值。

松露；游离氨基酸；反相高效液相色潽法；柱前衍生化；异硫氰酸苯酯；含量测定

松露又称块菌、无娘果、猪拱菌等，是子囊菌亚门，块菌目（tuberales）块菌属（tuber）的真菌。子实体在土壤中生长并成熟，是与树木共生的外生菌根型药食两用真菌。产地狭窄，80%以上分布于欧洲地区，近年来我国也有发现，尚未进行人工栽培。松露中含有丰富的多糖、蛋白质、脂肪、氨基酸、维生素和微量元素等营养成分[1-7]，本实验用柱前衍生化HPLC法对8个产地的新鲜松露中游离氨基酸进行测定，为松露的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

waters UPLC H-Class系统（含四元溶剂泵，自动进样装置，在线真空脱气装置，PDA检测器，Empower2色谱工作站），AB265-S十万分之一天平（瑞士METTLER公司），KQ-250E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），优普超纯水机（UPW-Ⅱ-60Z，成都超纯科技有限公司）。

1.2 试药

松露样品由北京上尚品生物科技有限公司提供；丝氨酸（批号121109）、甘氨酸（121024）、组氨酸（121022）、精氨酸（121102）、苏氨酸（121126）、脯氨酸（121031）、丙氨酸（121105）、酪氨酸（121201）、缬氨酸（121125）、蛋氨酸（121112）、胱氨酸（121107）、异亮氨酸（121013）、亮氨酸（120929）、苯丙氨酸（120922）、色氨酸（121027）、赖氨酸（121126）对照品均购于上海融禾医药科技有限公司，纯度≥98%；乙腈为色谱纯；水为超纯水，自制；异硫氰酸苯酯、盐酸、乙酸、醋酸钠为分析纯。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC figure

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C1（8250×4.6 mm，5 μm）；流动相A：醋酸钠15 g，加超纯水1 700 mL溶解，用乙酸调pH 6.5，加水至1 850 mL，加乙腈140 mL，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤。流动相B：80%乙腈水。梯度：0～18 min，A（100%～91%）；18.01 min～50 min，A（80%～67%）；52 min～60 min，A（0%）；流速0.8 mL/min；进样5 μL；检测波长254 nm；柱温：室温。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品贮备液的制备

分别精密称取16种氨基酸对照品15 mg，置于25 mL容量瓶中，胱氨酸用1 mol/L HCl溶解，其他氨基酸用水溶解并稀释至刻度。

2.2.2 供试品溶液的制备

取8个产地的松露鲜粉，精密称取1.0g，置具塞锥形瓶中，精密加入25mL蒸馏水，称定，超声提取30min，放冷，用水补足重量，摇匀，离心，取上清液待用。

2.2.3 衍生化试剂的配制

1.0 mol/L三乙胺乙腈溶液：移取三乙胺13.5 mL，置100 mL容量瓶中，加乙腈稀释并定容至刻度，摇匀即得。

0.1 mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液：移取异硫氰酸苯酯1.2 mL，置100 mL容量瓶中，加乙腈稀释并定容至刻度，摇匀即得。

2.3 衍生化

[8-9]的方法，取上述对照品或供试品溶液200 μL，加入0.1 mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，1.0 mol/L三乙胺乙腈溶液100 μL，摇匀，放置1 h，加入正己烷400 μL，摇匀，放置10 min，吸取下层溶液。

2.4 方法学指标考察

2.4.1 线性范围

取上述各对照品贮备液适量，置10 mL容量瓶中，水稀释并定容，按上述方法进行柱前衍生化，配成6个不同的浓度，进样5 μL，以16种氨基酸的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。线性回归方程和线性范围具体见表1。

表1 16种氨基酸的回归方程和线性范围（n=6）Table 1The regression equations and linear ranges of 16 kinds ofamino acids（n=6）

续表1 16种氨基酸的回归方程和线性范围（n=6）Continue table 1The regression equations and linear ranges of 16 kinds of amino acids（n=6）

从表1的结果来看，丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸等16种氨基酸分别在各自范围内线性关系良好。

2.4.2 精密度试验

精密移取各对照品贮备液200 μL，经衍生化后进样5 μL，重复进样5次，测定各氨基酸的峰面积。结果显示：18种氨基酸对应的峰面积RSD在0.87%～1.83%之间，仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验

精密称取文山黑松露样品6份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，经衍生化后测定游离氨基酸的峰面积，计算含量。结果表明：13种氨基酸的含量的RSD在1.66%～2.89%，方法重现性良好。

2.4.4 稳定性试验

取文山供试品溶液衍生化后，24 h内每3个小时进样一次，结果13重氨基酸的含量的RSD在0.74%～2.55%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.5 回收率试验

取已知氨基酸含量的文山松露样品6份，分别加入适量的苏氨酸、缬氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、甘氨酸，按供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，衍生化后测其峰面积并计算，结果样品中苏氨酸、缬氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、甘氨酸的平均回收率为98.75%、100.23%、99.31%、98.26%、99.43%、100.02%，RSD分别为1.02%、0.89%、1.53%、1.45%、0.73%、0.94%。

2.5 样品测定

取8个产地松露样品，按上述2.2.2项下方法分别制备供试品溶液，按2.3项下衍生化后，测定各样品中各游离氨基酸的峰面积，由外标法计算各氨基酸的含量。结果详见表2。

表2 8个产地松露中氨基酸含量测定结果（n=3）Table 2The contents of amino acids in 8 origin truffles（n=3）

从表2可以看出，本法共检出文山、永富产黑松露12种氨基酸，其中含7种必需氨基酸；从西昌、保山、贡山黑松露和文山白松露中均检出11种氨基酸，其中保山含7种必需氨基酸，其他产地6种必需氨基酸；平川黑松露和永仁母松露中共检出13种氨基酸，其中均含7种必需氨基酸；从氨基酸总量来看，黑松露属贡山产量最高，占5.38%，文山白松露优于其他产地黑松露，其中，永仁产母松s露质量最优，氨基酸总量达6.17%。采用本衍生化法同时测定了7个产地、3个品种的松露氨基酸种类及含量，在食品保健品的研究道路上具有新的开发意义。

3 讨论

1）提取方法选择：本实验采用了水加热回流和超声提取法提取松露中的游离氨基酸，经衍生化进液相分析，超声提取得到的氨基酸含量较大，可能原因是松露样品本身对热不稳定，容易变质，加热提取对松露质量有损。所以本实验选用超声提取，时间30 min，操作简便，提取效率高。

2）目前氨基酸柱前衍生化试剂主要有邻苯二甲醛、异硫氰酸苯酯等。本试验采用异硫氰酸苯酯与氨基酸反应，生成单一、稳定的苯氨基硫甲酰衍生物，于254 nm波长处紫外检测，得到的色谱峰峰型较好，分离度好，灵敏度高。

3）本实验结果显示，松露鲜品中含丰富的氨基酸，达11种～13种，其中含人体不能合成的非必需氨基酸6种～7种，占氨基酸总数的54%～64%。其中，不同产地的松露质量差异较大，文山和永富的松露非必需氨基酸含量较高，具有较高的医药用价值；就总氨基酸而言，永仁库的母松露含量最高，占6.17%。这些数据为松露的质量控制提供了依据，相信在不久的将来，松露这一药食两用菌很快会实现进一步的开发利用。

参考文献：

[1]刘洪玉,陈惠群,李子平,等.块菌的营养价值及其开发利用[J].资源开发与市场,1997,3(2):60-62

[2]王福强,张世奇.块菌的国内外研究及其有效活性成分的应用[J].农产品加工,2011(1):63-67

[3]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海:上海科学技术出版社,1978:274-277

[4]Chen H Q,Liu H Y,Yang X M,et al.Studied on the ecological and physiology property of truffle[J].Resour Dev Market,1999,15(1): 11-15

[5]Chen Y L.Mycorrhizal formation of Tuber melanosporum[J].Edib Fungi China,2002,21(5):15-17

[6]张世奇.块菌香气及多糖的研究[D].重庆:西南大学,2011

[7]刘长姣,于徊萍,李玉.块菌有效成分和活性研究进展[J].安徽农业科学,2012,40(4):2017-2019

[8]张莲,张煊,孟磊,等.柱前衍生RP-HPLC法测定桑叶中16种游离氨基酸的含量[J].中国药房,2008,19(36):2830-2832

[9]赵东升,马晓丽,李新霞,等.柱前衍生-高效液相色谱法同时测定可食药用葱属植物中18种游离氨基酸含量[J].药物分析杂志,2013,33(6):963-968

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详见中国天津食品网

（www.tjfood.com.cn）

Determination of Free Amino Acids in Multi-origin Truffles by HPLC

CHEN Li1，2，LU Juan1，*，FANG Bi-han1，3，ZONG Chuan-jie1，2，CHEN Xi1，*
（1.Chinese Academy of Medical Sciences Institute of Medicinal Plant Development，Beijing 100193，China 2.College of Pharmacy，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，Heilongjiang，China；3.Jia Mu Si University，Jiamusi 154007，Heilongjiang，China）

To establish a pre-column derivatization HPLC method to determine 16 kinds of amino acids in eight origin truffles.The amino acids in truffles were ultrasonically extracted with water and determined by high performance liquid chromatography using phenyl isothiocyanate as pre-column derivatization reagent.The eight -origin fresh truffles contain 11-13 kinds of amino acids，yongren mother truffles show highest content of 6.17%. The method is simple，fast，and reliable.Truffles content rich amino acids，which have a good development and utilization value.

truffle；free amino acids；RP-HPLC；pre-column derivatization；phenylisothiocyanate；determination

2013-08-29

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.026

国家自然科学基金资助项目（No.81173645）

陈莉（1988—），女（汉），硕士研究生，研究方向：中药质量标准研究。

*通信作者：路娟（1981—），女，助研，研究方向：中药质量标准。

陈曦（1973—），男，副研究员，研究方向：中药质量标准建立及血清药物化学。