实时荧光定量PCR技术在植物中的应用

崔颖++王秀娟++高山++王国泽

摘要：实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累来实现实时监测整个PCR反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术实现了PCR从定性到定量的转变。介绍了实时荧光定量PCR技术的原理、分类及优缺点，综述了近年来实时荧光定量PCR技术在植物中的应用概况及其研究进展，旨在为该技术的进一步开发应用提供理论参考。

关键词：实时荧光定量PCR技术；原理；内参基因；植物抗逆性；转基因产品

中图分类号：Q503；Q943.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）13-3073-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.13.001

The Application of Real-time Fluorescent Quantitative PCR in Plant

CUI Ying，WANG Xiu-juan，GAO Shan，WANG Guo-ze

（School of Mathematical Physics and Biology Engineering， Inner Mongolia University of Science and Technology，

Baotou 014010， Inner Mongolia， China）

Abstract： Real-time fluorescent quantitative PCR （RQ-PCR） is a detection method by adding fluorescent dyes or fluorescent probe into the PCR reaction system，using fluorescent signal accumulation to monitor amplification reactions of PCR reaction process，and finally the unknown template can be quantitative through the standard curve.So the detection level of PCR has improved from the qualitative to the quantitative.In order to provide theoretical reference for further application，the principle， classification，advantages and disadvantages of RQ-PCR were introduced，and its application and progress in plants in recent years were reviewed.

Key words：real-time fluorescent quantitative PCR（RQ-PCR）；principle；reference gene；stress resistance of plant；transgenic products

20世纪80年代凯利·穆利斯（Kary Mullis）发明了聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction， PCR）[1]。该技术是体外快速扩增特定基因或DNA序列最常用的方法。但其定量方法只能通过凝胶电泳检测扩增产物来进行分析，由于平台效应的存在，定量的准确性受到影响，且操作过程中易污染而使得假阳性率高。准确地说常规PCR是一种定性的技术。直到1996年Applied Biosystems公司推出实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR，RQ-PCR）技术，它不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，RQ-PCR具有简便易行、灵敏度高、特异性强等优点，而且也有效解决了常规PCR假阳性率高等缺点[2]。

1 RQ-PCR技术的概述

RQ-PCR技术是在PCR基础上发展起来的，它将核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测等技术融合在一起。RQ-PCR反应即是在常规PCR反应中加入荧光化学物质，随着PCR的不断进行，PCR产物在逐步积累，荧光信号也相应地发生有规律的变化。每经过一次循环就可以收集一个荧光信号。这样就可以绘出一条荧光扩增曲线图（图1）。通常，该图呈“S”型，分为3个时期：荧光背景信号阶段、荧光信号指数期和平台期[3]。

在荧光背景信号阶段，由于扩增的荧光信号会被PCR仪系统内部存在的固有荧光信号所遮盖，因此无法进行定量；在平台期，PCR的终产物量与起始拷贝数之间无相应的线性关系。只有在指数期，PCR产物量的对数值与起始模板量存在线性关系，可以由此阶段进行定量分析[4]。简而言之，所谓RQ-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

2 RQ-PCR的分类

RQ-PCR的类型分为探针式和非探针式。其中非探针式又成为染料法，是利用染料或特殊设计的引物来指示扩增的增加。其优点是简便易行，缺点是无特异性。而探针式则是利用与靶序列特异性杂交的探针来指示扩增产物的增加。其优点是特异性高，缺点是探针设计难度大，成本高。

2.1 探针式荧光检测技术

探针式荧光检测技术就是利用荧光共振能量转移原理来设计探针[5]，在探针5′端标记一个荧光报告基团（Reporter，R），3′端标记一个淬灭基团（Quencher，Q），二者可以构成能量传递。当R基团与Q基团距离较近时，Q基团可以吸收或抑制R基团发出的荧光；当R基团和Q基团相距较远时，Q基团则不能再吸收或抑制R基团所发出的荧光，这时R基团的荧光释放出来，荧光信号增强。常用的有TaqMan探针、分子信标等。endprint

2.2 非探针式荧光检测技术（染料法）

该方法是利用染料无法与单链DNA结合而可以与双链DNA结合并在结合时发出荧光信号，而在游离状态下则不发出荧光信号[6]的原理得以实现的。因此可以用荧光信号强度来代表双链DNA的数量，进而来计算PCR的扩增产物量。目前主要使用的是SYBR Green I。

3 不同荧光探针及SYBR Green I荧光染料的优缺点

不同荧光探针及SYBR Green I荧光染料的分类情况、优缺点对比及在实践中的应用概况如表1所示。

4 RQ-PCR的优缺点

RQ-PCR技术是在常规PCR技术下加入荧光染料或荧光探针，这样PCR的每次循环都会检测到荧光信号的变化。在进行RQ-PCR时，我们只需在加样时打开一次PCR反应管，之后所有的检测和定量都是在电脑分析软件下进行的。所以RQ-PCR与常规PCR相比存在许多优点，但也有自身的不足。其优点在于特异性好、准确性和自动化程度高且节约时间，缺点是所需热循环仪和试剂相对普通PCR昂贵[14，15]。

5 RQ-PCR技术在植物中的应用

RQ-PCR技术是一种很好的检测基因表达的方法，通过RQ-PCR可以分析植物在不同处理条件下基因样本的表达差异，也可以分析植物在不同生长发育时期基因表达的差异。

5.1 植物中内参基因的筛选

RQ-PCR是检测低丰度mRNA的敏感方法，通过比较不同样本的RNA产量、质量及逆转录上可能存在的差别，获得目的基因特异性表达的真正差异。但是在应用RQ-PCR检测目的基因表达量时，必须选择合适的内参基因进行校正和标准化[16]。内参基因是指其表达水平不受研究条件的影响且可以在多种样本间恒定表达的已知参照基因[17]。因此，内参基因在进行扩增中的变化可以反映出RNA数量、质量和cDNA合成效率的变化。

在植物学研究中，常用的稳定表达的内参基因有甘油醛-3-磷酸-脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因[18]、肌动蛋白基因（actin）[19]、微管蛋白基因（tubulin）[20]和18s RNA[21]等。然而，迄今为止尚未发现一种内参基因可适用于所有植物样本进行校正和标准化。因此，在进行RQ-PCR分析中，必须根据样品的不同来选择一种或一种以上的内参基因进行校正，以尽量去除试验中的不稳定因素[22]。geNorm软件是一种内参基因选择的良好工具，该软件首先将某一内参基因与其他内参基因表达水平进行两两比较和对数转换，获得平均标准差后并将该平均标准差作为基因表达稳定度的平均值M，然后将所有候选内参基因的M值进行排序，M值越小，基因表达稳定度越高，同时判定样本所需内参基因的最适数目[23]。

Kong等[24]用RQ-PCR检测了甜瓜在生物胁迫、非生物胁迫及植物生长调节剂处理的根和叶中以及果实不同发育阶段下14种常用内参基因的表达量，并确定了相应的最适内参基因。Borowski等[25]利用RQ-PCR分析了传统的14种内参基因和新的3种MIR169，MIR170/171，MIR172基因，发现生菜受到盐胁迫时传统的14种内参基因最为合适；而在重金属胁迫、干旱胁迫等非生物胁迫下，3种新的基因更适合做内参基因。Chan等[26]对采用RQ-PCR技术对油棕的内参基因进行了验证，发现pOP-EA01332，PD00380和PD00569的稳定性高于其传统的管家基因。

5.2 RQ-PCR技术对植物中抗性基因的表达分析

近年来对植物抗性基因的研究已经成为热点和焦点问题，传统的Northern blot和常规PCR方法很难准确和快速分析出该基因的表达量差异，而RQ-PCR技术具有快速和准确分析出植物在不同处理条件下该基因表达量差异的特点。

选取适当的内参基因，并设计出疑似抗性基因和已选取的内参基因引物，在对植物进行了不同处理后通过RQ-PCR技术检测疑似抗性基因和内参基因的表达量。其表达量的确定是根据标准曲线所得的线性计算出来的，就是将样品的Ct值代入公式，得到其相对浓度。同一个模板中的疑似抗性基因和内参基因的相对浓度的比值即可作为疑似抗性基因相对表达水平，从而来帮助确定抗性基因[27]。

徐德昌等[28]利用RQ-PCR技术检测了甜菜在低温胁迫下相关基因miRNA中表达的变化量，证明miRNA156、157、167、319、396是甜菜中响应低温信号的调控分子。冯静弦等[29]利用RQ-PCR技术检测拟南芥在热胁迫下的miRNA表达，发现mi414，415837-5p，f10546-akr这3种相关基因在表达量上发生了变化。扬帆等[30]和Srivastava等[31]采用RQ-PCR技术分别分析了盐胁迫下构树DREB转录因子基因表达量的变化及不同程度的盐胁迫下芥菜种子应答的全部基因组，并以此来鉴定抗逆性的信号传递。Song等[32]用cDNA-AFLP技术分析了河北杨在干旱胁迫下转录因子的差异表达，并利用RQ-PCR技术检测发现了不同失水量下的24个转录因子的差异表达模式。Dung等[33]通过RQ-PCR技术评测了大豆组织在各种非生物胁迫下的内参基因。

5.3 RQ-PCR技术在转基因产品中的应用

植株在转化过程中外源基因DNA片段是随机插入植物基因组内的，插入的拷贝数一般是不固定的。因此，转基因植物中外源基因拷贝数常影响目的基因的表达水平和遗传稳定性。由此可见，转基因研究中关键的一步就是检测外源基因的拷贝数，以筛选出拷贝数少或是单拷贝的转基因植株供给进一步的研究和育种[34]。

传统的转基因拷贝数检测主要是Southern blot，但该方法工作量大，需要的DNA材料较多，费时费力，并且经常需要用到放射性同位素等具有潜在危险的药品，而RQ-PCR具有高通量、快速、灵敏、安全等优点，近年来被广泛用于转基因产品的检测中[35]。endprint

5.3.1 用来确定是否为转基因食品 利用RQ-PCR技术，采用相对定量法，根据Ct值与起始模板数的对数值呈反比线性关系的原理制作标准曲线，获得Ct值与起始模板数的相对线性方程，将样品的Ct值代入该方程就可获得目的基因的起始模板数，通过与内参基因的比较就可以知道基因组中该外源基因拷贝数，由此则可以判断出该食品是否为转基因食品[36]。

目前已经用于对转基因的大豆、玉米、小麦、油菜等作物的检测[37]。Hernandez等[38]利用RQ-PCR技术对转基因玉米MON810中的转基因成分进行了检测。Taverniers等[39]利用RQ-PCR技术对转基因油菜子中的Barnase基因进行了检测。Mieog等[40]用RQ-PCR技术快速分析转基因谷物中的纯合体。Mohamed等[41]用RQ-PCR检测了转基因杏中的嵌合体并有效地监控其分离。Madhugiri等[42]利用RQ-PCR的灵敏性来检测木瓜种子转基因和非转基因的混合体。

5.3.2 用于转基因产品含量的检测 利用RQ-PCR技术分别对转基因标准品和待测样品进行扩增，记录下其各自内参基因和目的基因的Ct值，计算出标准品的内参基因和目的基因的Ct值之差，即△Ct，然后以标准品的转基因百分含量与△Ct作出标准曲线，并用标准曲线的回归方程计算待测样品中的转基因百分含量[43]。

目前TaqMan探针已经被用在转基因农作物的定量检测上，灵敏度达到0.1%[43]。Hird等[44]利用RQ-PCR技术对转基因大豆、玉米进行了检测，结果显示，大豆与标准含量的误差仅为0.1%，在3种不同玉米品种的误差仅为2.0%、10.0%和7.0%。陈颖等[45，46]利用RQ-PCR技术对大豆和玉米的内源基因和外源基因进行了检测并建立了商业化转基因大豆以及转基因玉米的定量方法。

5.4 RQ-PCR技术对植物同源基因的分析

利用RQ-PCR技术对植物同源基因进行检测，可以帮助理解用来编码蛋白质基因的功能[47]。Shimada等[48]利用RQ-PCR技术检测了拟南芥中油菜素甾醇的生物合成、分解和信号转导过程，为油菜素甾醇的代谢提供了一个更完整的途径。Anterola等[49]利用RQ-PCR证实了松树中有7个至关重要的基因对木质素前体物质的新陈代谢起到调节作用。

6 应用前景

因为RQ-PCR具有特异性好，精确性高，可以定量检测，并且误差小以及操作简便，自动化程度高，扩增和检测一步完成等优点，所以目前已广泛用于分子生物学和医学研究等领域，如mRNA表达和研究、SNP、人类和动物疾病的快速检测等方面[50]。随着分子生物技术的不断发展，再结合其他技术，RQ-PCR技术将会在许多领域有所发展，尤其是在植物育种、植物病理检疫等方面有望发挥更大的作用[51]。

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收稿日期：2014-11-15

基金项目：国家自然科学基金项目（31260406）；内蒙古自然科学基金项目（2012MS0502）

作者简介：崔 颖（1989-），女，内蒙古包头人，在读硕士研究生，研究方向为果蔬采后生物技术，（电话）15949482207（电子信箱）

cuiying_1989@126.com；通信作者，王国泽（1975-），女，内蒙古赤峰人，教授，博士，主要从事农产品加工与贮藏方向的研究，

（电子信箱）lycwgz@126.com。endprint