犬冠状病毒核衣壳蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

2015-08-08 10:16陈政晓王巧全
中国兽医杂志 2015年8期
关键词:包被克隆阴性

熊 炜,张 强,王 艳,陈政晓,蒋 静,王巧全,陈 沁,李 健

(1.上海出入境检验检疫局,上海 浦东 200135;2.上海大学生命科学学院,上海 宝山 200444)

犬冠状病毒病是一种以胃肠炎为主要症状的高度接触性传染病,它由犬冠状病毒(Canine coro⁃navirus,CCV)引起,临床上以犬严重脱水、呕吐、腹泻和血便为主要特征,致死率较低,但与其他传染病混合感染时,死亡率提高,对幼犬危害严重。目前,世界很多国家均已发现本病,是对养犬业危害较大的疫病之一。犬的健康与否与人类健康密切相关,以CCV为代表的冠状病毒极易变异,导致冠状病毒血清型众多,且新的血清型还在不断出现,为CCV的诊断和免疫预防带来了更大的困难[1-2]。从1996年首次报道分离出CCV以来,国内学者对CCV的诊断方法和CCV主要蛋白的编码基因进行了广泛的研究,已报道的主要检测方法有病毒分离、RT-PCR和核酸探针检测等[2-5],已报道的CCV功能基因的克隆和序列分析主要有TN449株的M基因、V1株的膜蛋白基因、部分S基因等[6-9]。本研究对CCV TN449株的核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,N)基因编码序列进行克隆和表达,并将表达的CCV N蛋白包被ELI⁃SA反应板,建立了CCV血清间接ELISA检测方法。

1 材料与方法

1.1 病毒株及阳性和阴性血清 CCV TN449株(ATCC编号:VR-989),由美国菌种保藏中心引进并保存。将该病毒在狗直肠瘤细胞系(A72)上扩增,取细胞裂解液备用。犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬传染性肝炎病毒(ICHV)、伪狂犬病病毒(PRV)和犬布鲁菌(CB)的阳性血清由本室保存。

1.2 主要试剂 TRIZol、逆转录酶,购自Invitrogen公司;Taq酶,购自Stratagene公司;RNA酶抑制剂、dNTP、DNA Marker、蛋白Marker、T4 DNA连接酶,购自TaKaRa公司;限制性内切酶BamH I和Not I,购自NEB公司;大肠杆菌感受态细胞(Top 10F和BL 21)、质粒抽取试剂盒、胶回收试剂盒、辣根过氧化物酶标记的羊抗犬IgG、TMB试剂,均购自天根生化科技(北京)有限公司;蛋白表达产物纯化采用GE公司HisTrap HP亲和柱。

1.3 引物设计 参照GenBank中登录的CCV TN449株的N基因序列(EF056485)设计引物,其上游引物(CCVNF)为:5′-CGGGGGCCAACCAGGGA CAACGCGTTAG-3′(BamH I),下游引物(CCVNR)为:5′-CCGGTTCGTTACCTCATCAATAATCTC-3′(Not I),扩增N基因大小为1149 bp。

1.4 RNA抽提和目的基因扩增 取200μL细胞裂解液进行RNA抽提,经反转录合成cDNA,采用PCR扩增目的基因。

1.5 目的基因和质粒载体的连接 PCR产物和质粒载体经BamH I和Not I酶切,并经胶回收纯化后,使用T4 DNA连接酶进行连接,并转化Top 10F大肠杆菌感受态细胞。

1.6 表达产物的SDS-PAGE电泳和Western Blot检测 将IPTG诱导的重组菌样品进行SDS-PAGE电泳,检测重组蛋白的表达。将表达的重组蛋白利用HisTrap HP亲和柱纯化后,进行蛋白电泳,并将蛋白转印至硝酸纤维素膜上,再使用CCV阳性血清和用辣根过氧化物酶标记的羊抗犬IgG作为二抗,对重组蛋白进行Western Blot鉴定。

1.7 抗原包被最佳浓度与血清最佳稀释度的确定 采用方阵试验测定。取纯化CCV N蛋白(浓度4.0 μg/mL),用磷酸盐缓冲包被液,按1∶2~1∶128进行稀释,包被ELISA板,4℃过夜;用PBST洗涤后,加入40 g/L PEG20000,37℃封闭2 h;用PBST洗涤后,将CCV阳性和阴性血清按1∶100~1∶800倍比稀释后,加入酶标板,37℃作用l h;用PBST洗涤后,加入1∶1000稀释的羊抗犬HRPIgG,37℃作用1 h;用PBST洗涤后,加TMB显色液,37℃作用15 min;最后加入H2SO4终止反应,读取OD450nm值。以阳性血清OD450nm值接近1.0,P/N值(阳性血清OD450nm/阴性血清OD450nm)≥2.0的抗原最大稀释度作为抗原最适工作浓度,其相应的血清稀释度为最佳血清稀释度。

1.8 间接ELISA阴阳性临界值的确定 采用建立的间接ELISA方法对本室保存的126份犬CCV阴性血清样本进行检测。每份样品重复3孔,结果取平均值,计算样本OD450nm的平均值(-X)和标准差(SD)。根据统计学,样本OD450nm值>阴性样本OD450nm值+2SD时,判定为阳性。

1.9 敏感性试验 将CCV阴性和阳性血清做1∶50~1∶12800倍比稀释后,用建立的间接ELISA方法进行检测。

1.10 特异性试验 用建立的CCV间接ELISA方法分别检测CDV、CPV、CPIV、ICHV、PRV和CB的阳性血清,以验证建立的间接ELISA方法是否对其他犬传染病的阳性血清具有交叉反应性。

1.11 临床样品的复检试验 使用建立的CCV间接ELISA方法对本室保存的36份CCV阳性犬血清和14份CCV阴性犬血清进行复测,以验证建立的间接ELISA方法的稳定性和可靠性。

2 结果

2.1 目的基因的RT-PCR扩增 将CCV TN449株在A72细胞上扩增,后提取细胞培养物中的RNA,采用RT-PCR对CCV的N基因进行扩增。结果显示,扩增的目的片段约1200 bp,与预期结果(1166 bp)(图1)。

图1 RT-PCR扩增CCV N基因

2.2 目的基因的克隆及产物的酶切鉴定 将PCR产物胶回收后,与质粒载体连接,转化感受态细胞,经平板筛选和酶切鉴定后,证实目的基因已重组入表达质粒(图2)。经测序,质粒中目的基因与报道的TN449株N基因(EF05648)同源性为98.6%。

图2 CCV的N基因重组质粒酶切鉴定

2.3 目的基因的表达及抗原性鉴定 将pETCCV-N1/BL 21重组菌进行6 h诱导表达,表达产物经SDS-PAGE进行分析。结果显示,与空载体对照及未经IPTG诱导目的基因克隆菌的蛋白电泳图相比,阳性克隆菌经IPTG诱导后,其电泳蛋白谱中出现了分子量大小为45 ku的目的基因表达产物(图3)。将表达的目的蛋白产物经SDSPAGE电泳、转膜,并使用CCV阳性血清进行Western-Blot分析,证实电泳蛋白谱中出现的45 ku的蛋白具有CCV蛋白的反应原性(图4)。

图3 CCV N基因表达产物的SDS-PAGE电泳图

2.4 抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定 经方阵试验测定,建立的CCV间接ELISA检测方法中,当CCV阳性血清为l∶100稀释、CCV N蛋白抗原的最佳包被浓度为1.0μg/mL(稀释倍数1∶4)时,阳性血清的OD值接近于1.0,而阴性血清的OD值较低,分布于0.05~0.2之间,P/N值≥5.0。因此,确定CCV阳性血清的最佳工作浓度为1∶100,相应的CCV N蛋白抗原的最佳包被浓度为1.0μg/mL。

图4 重组CCV N蛋白纯化产物的Western-Blot分析

2.5 间接ELISA阴阳性临界值的确定 在确定抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的基础上,采用建立的间接ELISA方法对本室收集和保存的126份犬CCV阴性血清样本进行检测。结果显示,这些血清的OD450值介于0.392至0.052间,其平均值为0.298,标准差SD为0.060,根据阴阳性临界值=+2SD得出该阴阳性临界值为0.418。因此,当待测样品的OD450nm值≥0.418时为阳性,而OD450nm值<0.418时为阴性。

2.6 间接ELISA敏感性试验 将纯化的CCV N蛋白抗原按最佳浓度和条件包被96孔板,再将CCV阴性和阳性血清分别做1∶50~1∶12800倍比稀释后,加入96孔板进行间接ELISA检测。结果显示,CCV阳性血清1∶6400稀释后仍检测呈阳性,而经1∶12800稀释后检测呈阴性。

表1 间接ELISA敏感性试验结果

2.7 间接ELISA特异性试验 用建立的CCV间接ELISA方法对CCV、犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬传染性肝炎病毒、伪狂犬病病毒和犬布鲁菌的阳性血清进行检测。结果显示,CCV阳性血清OD450值>1.0,而其他病毒和细菌感染阳性动物的血清OD450nm值均<0.418呈阴性,表明建立的间接ELISA方法具有良好的特异性。

2.8 临床样品的复检试验 使用建立的CCV间接ELISA方法对本室保存的36份CCV阳性犬血清和14份CCV阴性犬血清进行复检。结果显示,36份CCV阳性血清经间接ELISA检测均呈阳性,而所有阴性血清经复检均呈阴性,阴阳性符合率为100%。

3 讨论

2004年肆虐全球的“非典”(Severe acute respi⁃ratory syndrome,SARS)是由一种新型冠状病毒引起,它在世界上30多个国家不同程度的流行,导致了巨大的经济损失。SARS病毒和CCV均来源于物种相近的犬猫科动物,加强对CCV的研究和检测意义重大。本研究以美国ATCC引进的CCV参考毒株TN449株为对象,对其N蛋白编码基因进行克隆和表达,并证实该体外表达和纯化的N蛋白具有良好的抗原反应性;在获取纯化重组N蛋白基础上,在其包被于ELISA反应板,建立了CCV抗体间接ELISA检测方法,并确定了重组蛋白的最佳包被浓度、待检血清的最佳浓度和阴阳性判定的临界值。进一步将该间接ELISA方法用于多种常见犬病阳性血清的检测,证实该方法具有良好的特异性;将该方法用于2006年至2012年本室收集并保存的36份CCV阳性血清和14份阴性血清的复检,证实建立的间接ELISA方法具有良好的稳定性和可靠性,其阴阳性结果符合率为100%。

[1] Decaro N,Buonavoglia C.An update on canine coronaviruses:vi⁃ral evolution and pathobiology[J].Vet Microbiol,2008,132(3-4):221-234.

[2]张建武,陈燕军,吉荣,等.犬冠状病毒分子生物学研究进展[J].动物医学进展,2004,25(2):54-57.

[3]夏咸柱,胡桂学,李金中,等.犬冠状病毒在我国首次分离成功[J].中国兽医学报,1996,16(1):58.

[4]王权,张建武,李健,等.RT-PCR检测犬粪便中的冠状病毒[J].畜牧与兽医,2005,37(3):1-4.

[5]胡桂学,王龙涛,于守平,等.核酸探针检测犬冠状病毒方法的建立和初步应用[J].中国预防兽医学报,2003,25(3):11-14.

[6] 张建武,王权,李健,等.犬冠状病毒TN449株M基因的克隆与转移载体的构建[J].中国兽医科技,2005,35(8):590-594.

[7]乔军,夏咸柱,胡桂学,等.犬冠状病毒V1株膜蛋白基因的克隆与序列分析[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2004,32(12):75-78.

[8]关振宏,胡桂学,夏咸柱,等.大熊猫犬冠状病毒部分S基因的克隆与全S基因序列分析[J].中国预防兽医学报,2006,28(1):33-37.

[9]乔军,夏咸柱,杨松涛,等.犬冠状病毒流行株膜蛋白基因序列分析及其表达研究[J].中国病毒学,2006,21(5):458-462.

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