NIX介导的细胞自噬在低氧诱导ATⅡ凋亡中的作用

黄一，王婷婷，游凯，张明灿

NIX介导的细胞自噬在低氧诱导ATⅡ凋亡中的作用

黄一，王婷婷，游凯，张明灿

目的探讨NIX蛋白在低氧诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞（ATⅡ）凋亡中的作用。方法以自噬抑制剂和caspase抑制剂分别预处理人ATⅡ细胞株A549 1 h后，再低氧暴露24 h，Annexin V和碘化丙啶（PI）染色，流式细胞仪检测细胞凋亡。为了分析NIX介导的自噬在低氧诱导的ATⅡ细胞凋亡中的作用，以siRNA沉默NIX表达后，观察低氧暴露后细胞自噬水平的变化（MDC染色观察自噬溶酶体数量、Western blot检测自噬相关蛋白Beclin-1和LC3Ⅱ的表达变化）以及凋亡的变化。结果低氧诱导的细胞凋亡分别被自噬抑制剂和caspase抑制剂减弱；低氧暴露促进NIX表达并上调细胞自噬水平；沉默NIX能下调细胞自噬水平，减少低氧诱导的细胞凋亡，且作用可被caspase抑制剂减弱，而不被自噬抑制剂减弱。结论低氧暴露引起NIX蛋白表达而导致其介导的细胞自噬增加，这可能是低氧诱导ATⅡ细胞非caspase依赖性凋亡的机制之一。

肺泡；Ⅱ型上皮细胞；NIX；自噬；凋亡

低氧是急性肺损伤发生和发展的中心环节。肺泡上皮细胞最早暴露于低氧环境，易发生结构和功能损害。越来越多的证据表明，缺氧诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞（ATⅡ）凋亡在急性肺损伤中具有重要作用，但是目前对低氧诱导ATⅡ凋亡机制并未阐明。虽然目前认为caspase依赖的Fas/Fasl系统介导的凋亡为主要途径，但还有研究发现存在有NIX蛋白参与的非caspase依赖性的凋亡通路[1]。NIX蛋白与细胞自噬密切相关，并且我们前期研究发现，缺氧导致肺组织NIX蛋白表达明显增高，并且与ATⅡ细胞凋亡呈显著性正相关，但是其分子机制尚不明确。因此，本研究以低氧诱导人ATⅡ细胞株A549细胞凋亡，探讨NIX蛋白在低氧诱导ATⅡ凋亡中的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 肺泡上皮细胞培养及缺氧处理人肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549，ATCC，美国)以RPMI1640培养基+ 10%FBS常规培养，将细胞分为常氧组、低氧组、低氧组+自噬抑制剂组、低氧+caspase抑制剂组。常氧组细胞置常规培养箱内(95%空气，5%CO2，37℃)培养24 h；低氧组细胞置低氧培养箱内(1%O2，5% CO2，37℃)培养24 h；低氧组+自噬抑制剂组和低氧+caspase抑制剂组细胞，在低氧暴露前1 h分别将自噬抑制剂3-Methyladenine（3-MA，5 mM，Sigma，美国）和caspase抑制剂Z-VAD-FMK（20μM，碧云天，中国）加入到培养液中，之后再将细胞置于低氧培养箱内培养。

1.2 流式细胞仪检测细胞凋亡收集上述各组悬浮和贴壁细胞至离心管，离心后用预冷PBS重悬细胞，取5~10万个重悬细胞，1000 g离心5min，弃上清，加入195μl Annexin V-FITC结合液再次重悬细胞后，加入5μl Annexin V-FITC，混匀后再加入10μl PI染色液，室温避光孵育20min后置于冰浴中，使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（碧云天，中国）检测细胞凋亡，操作按说明进行。

1.3 MDC染色常氧组和低氧组细胞分别给予MDC（20μM，Sigma，美国）加入到培养液中，对照组给予等量载体溶剂（甲醇），孵育45 min后，荧光显微镜下观察。

1.4 NIX基因沉默装载NIX siRNA的腺病毒载体由广州锐博生物技术公司制备。siRNA序列为：F:5＇-AACAGUUCCUGGGUGGAGCUA-3＇;R 5＇-AA-CA CGUACCAUCCUCAUCCU-3＇。将病毒液加入细胞培养上清中感染细胞，4 h后更换新鲜RPMI1640+ 10%FBS培养液，12 h后可以看见绿色荧光。之后提取细胞总RNA和蛋白，以qRT-PCR和Western blot方法分别检测siRNA对NIX mRNA和蛋白水平的抑制效率。

1.5 Western blot分析RIPA裂解液（按1∶100添加PMSF）裂解细胞提取总蛋白，离心后取上清，BCA法测蛋白浓度。添加SDS上样缓冲液后，95℃变性5min，取20μg蛋白进行SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜，5%BSA室温封闭1 h，分别加入特异性抗体Beclin-1（1∶200，Santa，美国）、LC3Ⅱ（1∶200，Santa）、NIX（1∶500，Santa）、β-actin（1∶1000，碧云天，中国）于4℃过夜，漂洗后与HRP标记的IgG抗体37℃孵育1 h，以ECL试剂盒行放射自显影，Quantity One软件分析条带吸光度值。

2 结果

2.1 自噬抑制剂和凋亡抑制剂均可减轻低氧诱导的ATⅡ细胞凋亡分别以自噬抑制剂3-Methyladenine、凋亡抑制剂Z-VAD-FMK预处理细胞1 h后，再低氧暴露24 h，Annexin V和PI染色检测细胞凋亡结果显示，低氧能够显著诱导ATⅡ细胞凋亡，而3-Methyladenine和Z-VAD-FMK均可减轻低氧诱导的细胞凋亡(图1），提示在低氧诱导的ATⅡ凋亡，不仅由caspase介导，还可以通过自噬介导。

2.2 低氧促进ATⅡ细胞NIX表达及自噬水平增加低氧暴露24 h后，ATⅡ细胞中NIX蛋白表达水平较对照组显著增加（图2A），自噬相关蛋白beclin-1和LC3Ⅱ的表达显著增加（图2B、2C），并且细胞内自噬溶酶体数量较对照组显著增加(图2D)。

2.3 抑制NIX表达能减弱低氧诱导的细胞自噬水平增加构建以NIX为靶点的siNRA腺病毒载体并转染细胞，结果显示能有效抑制NIX表达（图3A）。且在低氧诱导后，siRNA组和对照组细胞自噬水平均较常氧条件下有所增加，但siRNA组细胞的增加幅度显著低于阴性对照组和空白对照组细胞，提示NIX参与调节低于氧诱导的细胞自噬（图3B-D）。

图1 自噬抑制剂和凋亡抑制剂均可减轻低氧诱导的ATⅡ细胞凋亡

图2 低氧促进ATⅡ细胞NIX表达并上调自噬水平

2.4 抑制NIX表达能减轻低氧诱导的细胞凋亡

分别以自噬抑制剂和caspase抑制剂预处理细胞1 h再低氧暴露24 h，流式检测细胞凋亡，结果显示沉默NIX后，低氧诱导的细胞凋亡显著低于对照组，并且3-Methyladenine能显著减少低氧诱导的细胞死亡，但Z-VAD-FMK对低氧诱导的细胞死亡作用不明显，提示NIX介导的自噬参与低氧诱导的ATⅡ细胞凋亡（图4）。

图3 抑制NIX表达能减轻低氧诱导的细胞自噬

图4 抑制NIX表达能减轻低氧诱导的ATⅡ细胞凋亡

3 讨论

本研究结果发现：（1）低氧暴露促进NIX表达并上调细胞自噬水平；（2）低氧诱导的细胞凋亡不仅由caspase介导，还由自噬介导；（3）沉默NIX能下调细胞自噬水平，减少低氧诱导的细胞凋亡，其作用可被caspase抑制剂减弱，而不被自噬抑制剂减弱。以上结果提示，在低氧暴露后，ATⅡ细胞中NIX蛋白表达上调引起细胞自噬水平增加，这可能是低氧诱导ATⅡ细胞非caspase依赖性凋亡的机制之一。

低氧是急性肺损伤的主要致病因素，也是导致ATⅡ细胞凋亡的主要原因[2-4]。ATⅡ因具有自我增殖和分化的作用，而在肺泡上皮损伤修复中具有重要作用[5-6]。因此，抑制ATⅡ细胞凋亡，对缺氧等因素引起的急性肺损伤修复具有重要作用。

细胞程序性死亡除凋亡外，还包括自噬性死亡[7]。细胞自噬是细胞在饥饿等条件下，细胞内受损、变性或衰老的蛋白和细胞器被溶酶体消化降解，是体内普遍存在的生理过程，在清除代谢废物转而进行能量回收中有重要作用。但过度的细胞自噬会引起细胞凋亡。自噬以自噬体的出现为特征，不依赖蛋白水解酶的作用，与凋亡具有显著区别。既往对急性肺损伤中ATⅡ细胞的凋亡主要集中于低氧暴露后引起caspase介导的细胞凋亡方面，但对自噬介导的ATⅡ细胞凋亡的报道减少。本研究发现，在低氧暴露后，细胞自噬水平显著增加。另外，与caspase抑制剂相似，自噬抑制剂能显著减弱低氧诱导的细胞凋亡，这说明低氧暴露诱导的ATⅡ细胞凋亡，除经典caspase凋亡途径外，还包括自噬性介导的凋亡。

促凋亡蛋白NIX是一种线粒体外膜蛋白，也称BNIP3L（Bcl-2/E1B-19K-interacting protein 3-like），是Bcl-2基因家族成员。其C末端含有一个跨膜区域可与线粒体膜结合，引起线粒体膜通透性转换孔开放，膜电位降低，活性氧增加，诱发细胞死亡[8]。另外，新近研究显示，NIX在调节细胞自噬中发挥重要作用[9]。我们前期研究发现，在急性肺损伤后，肺组织内NIX表达上调，并且与ATⅡ细胞的凋亡呈正相关。为了进一步探讨NIX在低氧诱导的ATⅡ细胞凋亡中的调节作用，本研究采用基因沉默技术抑制ATⅡ细胞NIX的表达。结果显示，抑制NIX表达后，细胞自噬对低氧的敏感性降低，提示在低氧暴露后，ATⅡ细胞自噬水平的增加主要由NIX介导。目前，在诱导细胞死亡的过程中，关于自噬与凋亡的关系仍未完全阐明。普遍认为，自噬与凋亡可能保持着动态平衡。另外，在不同的环境因素下，自噬也有可能抑制凋亡，保护细胞；自噬还可能启动凋亡，共同促进细胞死亡[10]。本研究观察到，抑制NIX表达后，低氧诱导的ATⅡ细胞的自噬水平和凋亡比例较对照组显著降低，说明NIX介导自噬参与低氧诱导的ATⅡ细胞凋亡。为了进一步明确NIX介导的自噬在低氧诱导的ATⅡ细胞凋亡中是以何种途径为主，本研究利用siRNA抑制NIX表达的细胞，分别给予自噬抑制剂和凋亡抑制剂预处理细胞，之后再将细胞暴露于低氧环境。结果显示，抑制NIX表达后，低氧诱导的细胞凋亡能被凋亡抑制剂显著抑制，但自噬抑制剂对此环节的抑制作用不明显，提示在低氧暴露诱导的ATⅡ细胞凋亡中，NIX主要介导的是自噬性凋亡。

综上所述，ATⅡ细胞在低氧环境下，NIX表达上调，其介导的细胞自噬水平增加，从而促进凋亡，这可能是低氧诱导ATⅡ细胞非caspase依赖性凋亡的机制之一。

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Effects of NIX mediated autophagy on hypoxia induced alveolar epithelial typeⅡcell apoptosis

Huang Yi,Wang Tingting,You Kai,Zhang Mingcan Departmentof Chest Surgery,Hospital 324 of PLA,Chongqing,400020,China

Objective To discuss the effects of NIX mediated autophagy on hypoxia induced alveolar epithelial typeⅡ(ATⅡ) cell apoptosis.Methods After pretreated respectively by autophagy inhibitor and caspase inhibitor for one hour,human ATⅡcell strain A549 then exposed in hypoxia for 24 hours and dyed by Annexin V and PI.The cell apoptosiswas detected by flow cytometry. In order to analyzed the effect of NIX mediated autophagy in hypoxia induced ATⅡcell apoptosis,siRNA was used to silence the expression of NIX,and then the changes in cell autophagy and apoptosis levels after the exposure to hypoxia were observed(MDC dyeingwas carried out to observe the lysosome amountof autophagy,and Western blot detection was carried out to test the changes in the expression of autophagy associated protein Beclin-1 and LC3Ⅱ).Results Hypoxia induced cell apoptosis was weakened by autophagy inhibitor and caspase inhibitor.Hypoxic exposure promoted NIX expression and increased the cell autophagy level.The silencing of NIX decreased autophagy level and hypoxia induced cell apoptosis,and its effect could be weakened by caspase inhibitor but not by autophagy inhibitor.Conclusion Hypoxic exposure results in the expression of NIX protein and increases NIX mediated autophagy,whichmay be one of themechanisms of hypoxia induced ATⅡcell caspase non-dependentapoptosis.

pulmonary alveolus;epithelial typeⅡcell;NIX;autophagy;apoptosis

R 563.9/364.4

A

1004-0188（2015）08-0847-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2015.08.012

2015-05-18）

重庆市卫生局医学科研项目（2013-2-306）

400020重庆，解放军324医院胸外科

张明灿，电话：023-68762060；E-mail:zhangmc324@sina. com