急性胃黏膜损伤大鼠前爪不同区域血含量及特定部位黑色素含量变化的研究

秦培洁等

[摘要] 目的 探讨生理、病理状态下大鼠上肢手掌不同区域血含量和上肢手掌皮肤黑色素变化，为气色形态手诊乃至中医学的“司外揣内”提供合理的研究方法和实验依据。 方法 随机将SD雄性大鼠20只分为正常组和模型组，每组各10只。利用无水乙醇灌胃复制急性胃损伤模型后，两组分别从大鼠尾静脉中给予一定浓度的伊文斯兰（EB）生理盐溶液。通过测量手掌不同部位组织内EB的吸光度（A）值大小，间接反映手掌各区域血含量的变化情况。利用多巴氧化酶检测两组大鼠前爪皮肤黑色素变化。 结果 ①模型组大鼠前爪5区的A值（0.96±0.46）显著高于正常组（0.35±0.17），差异有高度统计学意义（P < 0.01）。②模型组大鼠5区的黑色素细胞增多。 结论 应激性胃溃疡的大鼠的病理变化可以在手掌特定区域反映出，初步推断这种变化是通过血流量的变化和手掌皮肤的黑色素变化实现的。

[关键词] 手诊；急性胃黏膜损伤；大鼠前爪；血含量；黑色素含量

[中图分类号] R241 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）05（c）-0004-04

[Abstract] Objective To investigate the change of blood content and melanin in different area of forepaw skin in rat under physiological and pathological conditions， in order to provide reasonable research methods and experimental basis for hand diagnosis and Qisexingtai of traditional Chinese medicine. Methods Twenty SD rats were randomly divided into two groups， normal group and model group， with 20 rats in each group. Acute gastric mucosal injury model was established by intragastric administration of anhydrou ethanol. Rats tail vesns were injected a certain concentration Evan blue （EB） saline solution. Then， by detecting the photo-absorption rate （A value） of the EB in the tissues of the different zones of forepaws， the changes of blood contents in the different areas was examine indirectly. The melanin of rat forepaw skin was detected by dopa oxidase. Resluts ①The A values in 5 zones of model group （0.96±0.46） was higher than that of normal group （0.35±0.12）， the differences was statistically significant （P < 0.05）. ②The melanin in 5 zones were significantly increased. Conclusion The pathological changes of stress ulcer in rats can be reflected on particular area of forepaw in acute gastric mucosa injury rats， preliminary conclusion the change is realized through the blood flow change and the palmar skin melanin change.

[Key words] Hand diagnosis； Acute gastric mucosa injury； Rat forepaw； Blood content； Melanin content

气色形态手诊是在中医望色诊病理论基础上建立起来的，对受伤特定部位的气、色、形态变化进行有目的的观察，并对收集到的信息进行分析，以了解人体健康状况的一种诊断方法[1-3]。本研究探讨生理、病理状态下大鼠上肢手掌不同区域血含量和上肢手掌皮肤黑色素变化，为气色形态手诊乃至中医学的“司外揣内”提供合理的研究方法和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂

SD雄性大鼠（8周龄）20只，平均体重（250±10）g（中国军事医学科学院提供，批号：0019071）。伊文斯兰（Evans blue，EB）（FLU KA进口分装），75%乙醇（上海利康消毒高科技有限公司），多巴胺氧化酶（DopA）（Cayman），磷酸氢二钠（biotopped），磷酸氢二钾（福晨化学），甲醛溶液（sigma），硫酸铝（sigma）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组

将20只大鼠适应性喂养1周后，随机分为两组，正常组和急性胃黏膜损伤模型组（模型组），每组各10只。

1.2.2 模型建立

模型组大鼠按照2 mL/kg比例腹腔注射0.9% NaCl溶液，1 h后用75%乙醇，按照1 mL/100 g比例进行灌胃，进而诱导成急性胃黏膜损伤模型；正常组大鼠则按照2 mL/kg比例腹腔注射0.9% NaCl溶液。

1.3 观察指标

1.3.1 形态学观察

肉眼观察两组大鼠的胃大体标本和前爪特定部位的皮肤标本。

1.3.2 胃溃疡指数

用4%甲醛溶液固定各组大鼠的胃组织，沿胃大弯剪开，显微镜下观察出血性病灶，采用测微尺计算胃黏膜损伤面积。计分标准：0分：正常胃黏膜；1分：点状损伤；2分：病损<1 mm；3分：1 mm≤病损<2 mm；4分：2 mm≤病损<3 mm；依次类推，胃溃疡指数=全胃评分的总和[1]。

1.3.3 组织病理学检查

取大鼠胃窦部组织，石蜡切片，行苏木精-伊红（HE）染色，光学显微镜下观察大鼠胃壁 4 层结构是否清晰，胃黏膜表面是否光滑，上皮是否完整，腺体排列是否整齐。

1.3.4 大鼠前爪特定部位血含量变化测定方法

1.3.4.1 EB标准曲线的制作 根据参考文献[2]结合本实验的要求进行改良，丙酮和生理盐溶液按照7∶3混合后中加入EB，配制成溶度为25、125、625、3.12、1.56、0.78、0.39 μg/mL的溶液。用722型分光光度计在600 nm测量吸光度（A）值，测量方法：在600 nm处用722型分光光度计测得，其中浓度为横坐标，A值为纵坐标。从图1可见EB溶度与A值之间存在较好的线性关系，其回归直线方程：Y = 0.028X+0.027，r = 0.9990，为EB标准曲线。

1.3.4.2 实验方法 大鼠适应性饲养1周后，禁食不禁水24 h，术前2 h禁水。模型组大鼠按照2 mL/kg比例腹腔注射0.9% NaCl溶液，1 h后用75%乙醇，按照1 mL/100 g比例进行灌胃，进而诱导成急性胃黏膜损伤模型；空白组大鼠则按照2 mL/kg比例腹腔注射0.9% NaCl溶液，1 h后按照1 ml/100 g比例用0.9% NaCl溶液灌胃。2 h后麻醉取胃，脱颈椎处死大鼠后迅速从前肢肘后剪下前爪，放2℃冰箱冰箱冷藏10 min后取出固定在塑料泡沫上，放入液氮中，进而转移到-20℃冰箱冷冻。依据大鼠前爪蹼的分布特点，参考气色形态手诊特点[3]，由图2可见沿蹼边界将大鼠前爪分为9个区域[4]，每区分别取区域内肌健以上组织，放7∶3丙酮生理盐溶液中浸泡72 h，以1500 r/min离心10 min，用722型分光光度计在600 nm处测量上清液的A值[5]。

1.3.5 大鼠前爪特定部位黑色素变化测定[6-8]

1.3.5.1 试剂配制 0.0056 mol/L DopA液的配制：称取DopA 1.10 g，溶解于1000 mL蒸馏水。0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）配制：A液，0.1 mol/L磷酸氢二钠35.8 g溶解于1000 mL蒸馏水；B液，磷酸二氢钾13.6 g溶解于1000 mL蒸馏水；取A液9份与B液1份混合，pH调至7.4。孵育液配制法：0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4），溶入0.0056 mol/L的DopA内。将配制好的孵育液保存于冰箱内备用。

1.3.5.2 操作步骤 取大鼠5区皮肤作为标本，用10%甲醛固定组织1 h（22℃）或4～8 h（4℃），修切已固定的组织块，厚3～5 mm，流水冲洗3 min，组织块浸于孵育液中1 h（37℃）流水冲洗2～6 h，在Bouin液中重新固定24 h。各级乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚度8 μm，用5%硫酸铝水溶液配制的0.1%核固红，复染10 min，流水冲洗片刻至核深红色，胞质带红色为止。最后脱水、透明，中性树胶封片。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃溃疡形态学观察

正常组和模型组大鼠胃大体的形态学观察特点总结见表1，具体形态见图3～4（封三）。

2.2 胃溃疡指数

与正常组比较，模型组的胃溃疡指数（78.39±15.98）显著升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01），提示造模成功。

2.3 组织病理学观察

空白组大鼠的胃没有明显的炎症细胞浸润，具有较为完整的胃黏膜，黏膜、黏膜下层、肌层及浆膜层结构完整，胃小凹结构和黏膜腺体排列整齐。见图5（封三）模型组大鼠的胃黏膜结构排列紊乱，黏膜上皮层在部分区域缺失，甚至累及胃黏膜固有腺体，并伴有大量炎症细胞浸润，溃疡床有肉芽组织形成。见图6（封三）。

2.4 大鼠前爪特定部位血含量变化

正常组大鼠前爪各区的A值普遍较低。模型组大鼠前爪除5区外，其他均未明显升高（P > 0.05）；而模型组大鼠前爪5区的A值则明显升高，显著高于正常组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表2。

2.5 大鼠前爪特定部位黑色素变化

由图7～8（封三）可见，与正常组比较，模型组的黑色素细胞增多。

3 讨论

气色形态手诊时在中医望色诊病理论基础上建立起来的，在传统中医理论指导下结合临床实践由刘剑锋教授首次提出的创新中医诊断方法。20多年来已在临床实践中得到了大量的验证和推广[9-12]。在大量临床实证的基础上，近年来课题组致力于寻找气色形态手诊的机制以期为中医“司外揣内”理论提供研究方法和实验依据。在气色形态气色形态手诊理论中，胃区位于手掌的正中心，呈正圆形，向左不超过生命线，向右不超过无名指竖直平分线，而在病理状态下，该区的气色形态将发生一定的改变[3]。

通过本课题组的前期研究发现，临床和实验中多用EB作为血清蛋白的标志物测定血浆容量[11]，对于应激性胃溃疡这种急性损伤而言，一方面考虑是该区域血含量发生变化而导致视觉上的变化，另一方面考虑是否导致该区域黑色素细胞增加进而会有视觉上的改变。基于此假设，本课题组开展了研究，发现模型组大鼠前爪的5区A值也就是胃区的A值显著高于正常组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。说明假设成立，应激性胃溃疡可导致大鼠前爪胃区的血流含量发生变化进而引起视觉的改变，进一步验证了本课题组前期的工作。本研究采用多巴氧化酶法[13-14]检测各组大鼠前爪皮肤黑色素情况，通过图7～8（封三）可以看出模型组大鼠的5区黑色素细胞明显增多，为假设提供了初步佐证，至于其机制如何，有待课题组的进一步研究。

[参考文献]

[1] 魏伟，吴希美，李元健.药理试验方法学[M].北京：人民卫生出版社，2002.

[2] 卢新华，谷彬，罗金荣.苦菜总黄酮对小鼠脑缺血缺氧保护作用的实验研究[J].时珍国医国药，2007，18（2）：399-400.

[3] 刘剑锋.中国手诊手疗行业技术规范标准化培训认证教材[M].北京：中医古籍出版社，2007.

[4] 刘剑锋，余晴.大鼠上肢手掌特定区域血含量的探索研究[J].中国中医基础医学杂志，2008，14（9）：670-671.

[5] 吕明庄，贺志光.仙方玉容膏治疗皮肤瘙痒症的临床和实验研究[J].云南中医中药杂志，1998，19（4）：31-33.

[6] d'Ischia M，Napolitano A，Ball V，et al. Polydopamine and eumelanin：from structur-property relationships to a unified tailoring strategy[J]. Accounts of Chemical Research，2014，47（12）：3541-3550.

[7] Zaidi K U，Ali A S，Ali S A. Purification and characterization of melanogenic enzyme tyrosinase from button mushroom[J]. Enzyme Research，2014，2014：120739.

[8] Asanuma M，Miyazaki I，Diaz-Corrales FJ，et al. Transplantation of melanocytes obtained from the skin ameliorates apomorphine-induced abnormal behavior in rodent hemi-parkinsonian models[J]. PloS one，2013，8（6）：e65983.

[9] 刘剑锋.观手知病气色形态手诊法精要[M].北京：中国科技出版社，1991：52.

[10] 刘剑锋，周立峰，邱波.手特定部位气色形态与脑动脉硬化症关系的临床研究[J].山东中医杂志，2009，28（1）：11-12.

[11] 王甜，余晴，刘剑锋，等.急性肺损伤大鼠前爪对应部位血EB含量变化研究[J].中国医药导报，2013，10（3）：21-23.

[12] 刘剑锋，余晴，王甜.乙酸诱导大鼠结肠炎后前爪特定部位血含量变化研究[J].山东中医药大学学报，2009， 33（1）：58-59.

[13] 贾宇臣，陈琦，李少伟，等.新生小鼠不同部位皮肤毛囊早期发育差异的比较[J].中国实验动物学报，2014，22（3）：84-87.

[14] 董妙珠，肖萍，洪新宇，等.不同染色法检测豚鼠皮肤黑色素的比较研究[J].环境与职业医学，2006，23（5）：423-425.

（收稿日期：2014-11-01 本文编辑：苏 畅）