正交试验优选蓝莓抗疲劳口服液提取工艺

胡一冰，聂忠莉，谢贞建，刘 涛，吴晓腊

(成都大学 生物工程学院，四川 成都 610106)

0 引 言

蓝莓又称越橘，蓝浆果，为杜鹃花科越橘属植物，营养丰富，药用价值高，除含有花青素、SOD、黄酮类化合物、酚类等多种活性成分，还含有多种人体所需的维生素、微量元素、氨基酸等物质，具有抗衰老、增强机体免疫力、抗疲劳、降低血糖、保护视力、抗肿瘤等多种功能作用［1－3］.通过对相关文献资料查阅与比对分析发现，利用蓝莓与中药配伍组成保健食品的还不多见，为了更好地开发蓝莓，本实验选择蓝莓、白术、当归进行配伍组成抗疲劳口服液，并对其提取工艺进行了研究.

1 材料与仪器

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试 剂.

实验所用试剂包括:苯酚、浓硫酸、葡萄糖、乙醇、甲醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯;芦丁对照品由中国药品生物制品检定所提供;实验用水为纯净水.

1.1.2 仪 器.

实验所用仪器包括:UV－3200S 型紫外分光光度仪(上海美谱达仪器有限公司);LD2000－1 型电子天平(沈阳龙腾电子有限公司);DHG－9246 型恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);RE－52B 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);HH－4型数显恒温水浴锅(常州澳华仪器有限公司).

1.2 药 材

实验所用药材:炒白术、当归购自成都北京同仁堂药店，蓝莓购自成都伊藤洋华堂(春季蓝莓).

2 方 法

2.1 蓝莓抗疲劳口服液正交试验设计

在单因素试验基础上采用正交试验优选提取工艺，采用L9(34)正交试验.分别以多糖的含量、总黄酮的含量为指标，对煎煮时间、煎煮次数、配伍比、料液比4 个因素，分别设3 个水平进行考察.其中，蓝莓∶ 白术当归中，白术当归比为5∶ 1.以上因素水平见表1.

表1 正交法提取蓝莓抗疲劳口服液的因素与水平表

2.2 蓝莓抗疲劳口服液制备

选择新鲜、成熟度好，并剔除病虫害、变色、变质等不合格蓝莓，在流动水中洗净、沥干.白术、当归按物料比准确称取，并按表1 正交试验设计要求加水煎煮提取.煎煮前，白术、当归先用适量水浸泡30 min，煎煮液用4 层纱布滤过，合并，浓缩至120 mL.制得9 份煎煮液，冷却后置于冰箱冷藏备用.

2.3 多糖含量测定方法

2.3.1 多糖标准曲线的制备.

精密称取105 ℃烘干至恒重的标准葡萄糖100.4mg 于100 mL 容量瓶中，加水至刻度、摇匀，吸取此液10 mL 于100 mL 容量瓶中，摇匀，制得浓度为0.1004 mg/mL 葡萄糖溶液.

精密量取葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于10 mL 刻度试管中，依次加水至2 mL，摇匀.然后各加入5%苯酚溶液1 mL，浓硫酸5 mL，振摇5 min，于沸水浴中加热15 min，冷却.以2 mL 蒸馏水作空白.在波长490 nm 处测定吸光度.以吸光度值为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(Xmg/mL)进行回归，回归方程为，

y=50.959x+0.017，R2=0.9980.

2.3.2 样品含量测定.

分别精密吸取样品溶液2 mL，按“2.3.1”项下方法测定，并用回归方程计算多糖含量［4］，计算式为，

2.4 芦丁含量测定方法

2.4.1 芦丁标准曲线的制备.

精密称取在120 ℃干燥至恒重的芦丁对照品约100 mg，置50 mL 容量瓶中，加甲醇适量，置水浴上微热溶解，放冷至室温后用甲醇定容至刻度.精密吸取10 mL，置100 mL 容量瓶中，加水至刻度，摇匀，制得2 mg/mL 对照品溶液.

精密量取对照品溶液0、2、3、4、5、6、7 mL，分别置于25 mL 容量瓶中，各加水至7 mL，5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加4%氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以不含芦丁相应试剂为空白，在波长510 nm 处测定吸光度.回归方程为，

y=10.841x+0.0016，R2=0.9997.

2.4.2 样品含量测定.

分别精密吸取样品溶液7 mL，按2.4.1 项下方法测定，并用回归方程计算黄酮含量［5］，计算式为.

3 结果与分析

正交试验结果统计与方差分析如表2、3、4 所示.

方差分析的结果表明:以多糖提取率为指标，煎煮时间、煎煮次数和料液比对多糖提取率有一定影响，影响因素的顺序为D ＞B ＞A ＞C.综合考虑多糖提取率及节省能源等因素，确定最优工艺为A2B3C1D2，即煎煮时间2 h，煎煮次数3 次，蓝∶ 白术当归比例为2∶ 1，其中白术与当归之比为5∶ 1，料液比1∶ 15.以总黄酮提取率为指标，煎煮各因素影响作用不大，影响因素的顺序为C ＞A ＞D ＞B，即蓝莓白术当归比例＞煎煮时间＞料液比＞煎煮次数.综合考虑总黄酮提取率及直观分析等因素，确定最优工艺为A3B2C1D3，即煎煮时间3 h，煎煮次数2次，蓝∶ 白术当归比例为2∶ 1，其中白术与当归之比为5∶ 1，料液比1∶ 20.

表2 蓝莓抗疲劳口服液提取L9(34)正交实验结果

表3 蓝莓抗疲劳口服液多糖提取率的方差分析

表4 蓝莓抗疲劳口服液总黄酮提取率的方差分析

4 讨 论

中药煎煮过程中，药材直径大小、粉碎程度会影响药材有效成分溶出.为了保证和新鲜蓝莓处理的一致性，在煎煮前，本实验对所有原料进行了粗略剪碎.原料中水煎煮涉及较多有效成分为多糖和黄酮类，多糖常采用水提工艺，通过正交试验结果和方差分析筛选出有显著性差异的优化条件.有报道指出，黄酮类成分多采用醇提工艺，热水提的工艺得到黄酮较醇提低［6］.为了兼顾多糖提取，本研究选取水提方法.虽然方差分析显示水提条件对黄酮成分优化影响没有显著性，但是后期的抗疲劳药理实验证实是有显著性差异的［7］.因此，在实验中，保留水提黄酮的制备工艺条件.同时，本研究探讨了蓝莓抗疲劳口服液蓝莓与白术当归之间，以及白术与当归之间的比例，取得了一些研究价值，为下一步的深入研究提供了基础数据.

［1］王莹，王鸿，蔡东联.蓝莓及其提取物保健功效的研究进展［J］.医学研究杂志，2013，42(7):180－182.

［2］赵秀玲.蓝莓的成分与保健功能的研究进展［J］.中国野生植物资源，2011，30(6):19－23.

［3］鞠宝兆.中药抗疲劳机制及方药的筛选规律［J］.中国临床康复，2004，8(18):3656－3657.

［4］吕培霖，晋玲，郑明霞.不同产地款冬花多糖含量测定［J］.现代中西医结合杂志，2009，18(15):1758－1759.

［5］陈雪英，霍金海，刘芳萍.正交试验法优选丁香叶中总黄酮提取工艺［J］.东北农业大学学报，2013，44(9):144－148.

［6］涂华，陈碧琼，张燕军.天然类黄酮物质的提取工艺研究进展［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17(6):277－279.

［7］李倩，罗祖良，杨小丽，等.中药质量控制方法研究述评［J］.中医学报，2012，27(4):448－451.