L-谷氨酰胺治疗大鼠非酒精性脂肪肝病

张 黎，牛世伟，李晓波，刘 华，黄 红，李 燕*，李树德

(1.云南省第一人民医院 干部保健科，云南 昆明 650032； 2.昆明医科大学 基础医学院, 云南 昆明 650504；3.昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650504)



L-谷氨酰胺治疗大鼠非酒精性脂肪肝病

张 黎1，牛世伟1，李晓波1，刘 华1，黄 红1，李 燕1*，李树德2*

(1.云南省第一人民医院 干部保健科，云南 昆明 650032； 2.昆明医科大学 基础医学院, 云南 昆明 650504；3.昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650504)

目的观察L-谷氨酰胺对非酒精性脂肪肝病大鼠的作用。方法将大鼠随机分为对照组、高脂饮食组及L-谷氨酰胺治疗组，高脂饮食组与L-谷氨酰胺治疗组用高脂饮食建立非酒精性脂肪肝病模型，造模成功后给予相应治疗，8周后处死大鼠并检测相关指标。结果治疗组相较于高脂饮食组的炎性反应明显减轻，脂肪空泡减少；治疗组的LDL、AST、TBA、 CHOL、TG、LDL-C、IL- 6、TNF-α、IL- α、IL- β、MDA及CRP较高脂饮食组明显降低(P<0.05)，GSH、T-AOC、HDL-C明显升高(P<0.05)，SREBF1和ACCαmRNA与蛋白表达明显下降 (P<0.05)，PPARαmRNA及蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论L-谷氨酰胺可缓解大鼠非酒精性脂肪肝病症状，其机制可能是通过降低SREBF1及ACCα表达、同时增加PPARα表达实现的。

非酒精性脂肪肝；L-谷氨酰胺；肝功能；过氧化物酶体增殖物激活受体α；乙酰辅酶A羧化酶α；固醇原件调节因子1

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是代谢性疾病的一种，临床可分为单纯性非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪肝炎及由其后续发展造成的肝纤维化、肝硬化甚至肝癌、肝功能衰竭等[1]。当前非酒精性脂肪肝病已经变成了威胁中国人健康的一大疾病[2]。L-谷氨酰胺是肠道必需的一种营养物质，近年来的研究发现，L-谷氨酰胺可以修复肠道L-细胞，同时可刺激肠道L细胞促进GLP-1的释放[3]。本实验通过高脂饮食建立非酒精性脂肪肝病大鼠模型，通过观察大鼠肝功能、血清生化指标、炎性因子以及氧化和抗氧化能力的观察，同时分析其肝脏固醇原件调节蛋白1(SREBP- 1c)、乙酰辅酶A羧化酶α(ACCα)以及过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα) mRNA和蛋白的表达。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物来源：60只清洁级雄性SD大鼠，体质量160～180 g，昆明医科大学动物实验部提供[合格证号：SYXK(滇)2011- 0004]。

1.1.2 药物及试剂盒来源: L-谷氨酰胺(日本株式会社)；胆固醇(北京鼎盛生物科技有限公司)；胆酸钠(上海金穗生物有限公司)；CHOL、TG、LDL-C、HDL-C、GSH、GST、T-AOC、SOD以及MDA试剂盒(南京建成生物公司)；ALT、AKP、r-GT、AST以及CRP等试剂盒(Bio-Swamp公司)；LDH试剂盒(上海谷研生物有限公司)；多克隆抗体SERBF- 1、ACC、PPARα、单克隆抗体β-actin、PVDF膜及ECL发光试剂盒(Santa Cruz公司)；相应二抗(中山金桥公司)；总RNA提取试剂盒(北京天根生物有限公司)；BCA蛋白定量试剂盒(Merck公司)。

1.2 方法

1.2.1 非酒精性脂肪肝病模型的建立与治疗方法: 60只大鼠随机分为对照组(control，CON)、高脂饮食组(high fat group，HFD)及L-谷氨酰胺治疗组(L-glutamine group，L-Gln)，每组20只，HFD组及L-Gln组给予基础饲料+高脂溶液灌胃，高脂溶液的灌胃量为1 g猪油/100 g大鼠体质量。12周后每组分别处死4只大鼠，检验造模是否成功。L-Gln治疗组每天给予L-谷氨酰胺 1 g/kg 灌胃治疗，8周后进行实验观察。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 HE染色

CON组无任何脂滴浸润现象；HFD组表面有不同程度的脂肪变性及空泡样变；L-Gln组脂肪变性程度及细胞肿胀明显减轻，坏死灶较HFD明显减少，但在汇管处仍有小部分面积脂肪颗粒堆积(图1)。

2.2 肝功能

L-Gln组与HFD组相比，LDH及AST明显降低(P<0.05)； ALT、AKP及 r-GT 变化不明显(表1)。

2.3 血脂

L-Gln组的CHOL、TG以及LDL-C比HFD组均有明显的降低，HDL-C明显升高 (P<0.05) (表2)。

2.4 血清炎性因子

L-Gln组的IL- 6、TNF-α、IL- α及IL- β较HFD组明显降低(P<0.05)(表3)。

2.5 血清氧化和抗氧化指标比较

L-Gln组的血清GSH以及血清T-AOC较HFD组明显升高(P<0.05)，MDA及CRP明显降低(P<0.05)(表4)。

2.6 SREBF1、ACCα以及PPARα mRNA表达

L-谷氨酰胺治疗组SREBP1及ACCαmRNA表达较HFD组明显下降 (P<0.05)，PPARαmRNA则明显升高(P<0.05) (图2)。

A.CON； B.HFD； C.L-Gln图1 肝脏切片HE染色Fig 1 HE staining of liver(×100)

表1 各组大鼠治疗8周后肝功能指标比较Table 1 Comparison of liver function in rats after 8 weeks treatment(±s, u/L, n=20)

*P<0.05 compared with HFD.

表2 各组大鼠治疗8周后血脂指标比较Table 2 Comparison of blood lipids in rats after 8 weeks treatment(±s, mmol/L, n=20)

*P<0.05 compared with HFD.

表3 各组大鼠治疗8周后炎性因子指标比较Table 3 Comparison of inflammatory cytokines in rats after 8 weeks treatment(±s, pg/mL, n=20)

*P<0.05 compared with HFD.

表4 各组大鼠治疗8周后氧化和抗氧化能力指标比较Table 4 Comparison of oxidation and antioxidant capacity in rats after 8 weeks treatment(±s, n=20)

*P<0.05 compared with HFD.

*P<0.05 compared with HFD图2 肝脏SREBF1、ACCα 以及PPARα mRNA表达Fig 2 Expression of SREBF1, ACCα and PPARα mRNA in liver

2.7 SREBF1、ACCα 以及 PPARα蛋白表达

L-谷氨酰胺治疗组SREBP1以及 ACCα 蛋白表达较HFD组有明显下降 (P<0.05)，PPARα 蛋白表达则明显的升高(P<0.05) (图3)。

2.8 胰岛素抵抗指数

L-Gln组胰岛抵抗指数较HFD组有明显下降 (P<0.05) (图4)。

3 讨论

目前医学界公认的NAFLD的发病机制为“二次打击学说”，二次打击可分为第一次打击和第二次打击2个部分[4]。胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)是肝脏第一击的关键，IR的升高可以促进升高SREBP- 1转录因子，而SREBP- 1是参与脂肪合成同时促进其在肝脏聚集的关键酶。SREBP- 1的升高还可以促进ACCα 酶的的表达，ACCα在体内主要参与脂肪酸的合成，二者协同作用可以促进脂肪颗粒堆积在肝脏，导致非酒精性脂肪肝的发生。谷氨酰胺可以促进GLP- 1的释放进而治疗糖尿病[5]，同时GLP- 1类似物艾塞那肽可以促进脂肪肝病的改善[6]。因此本次研究依据上述机制来观察L-谷氨酰胺对非酒精性脂肪肝是否有作用。氧化应激是第二次打击因子中的关键一环[7]。当肝细胞中脂质的过度累积到一定程度时，会出现在一个或多个线粒体途径的中心促进氧化应激，导致脂质过氧化反应，并最终促进肝细胞的损伤，甚至导致肝细胞死亡。

*P<0.05 compared with HFD图3 肝脏SREBF1、ACCα 以及PPARα 蛋白表达Fig 3 Expression of SREBF1, ACCα and PPARα protein in liver

*P<0.05 compared with HFD图4 胰岛素抵抗指数Fig 4 Insulin resistance index

本研究显示，L-谷氨酰胺治疗后，胰岛素抵抗指数明显降低，同时肝脏提取液中SREBP- 1和ACCα mRNA和蛋白表达在治疗组均明显低于模型对照组，血清总胆固醇、三酰甘油、LDL-C明显降低，HDL-C明显升高。提示谷氨酰胺可降低IR，通过IR的降低最终促进了SREBP- 1和ACCα mRNA和蛋白表达降低，最终改善了大鼠肝脏的脂肪代谢。L-谷氨酰胺治疗后，大鼠PPARα mRNA和蛋白表达明显升高，炎性因子IL- 6、TNF-α、IL- 1α、IL- 1β明显降低，同时T-AOC及GSH明显增加，提示过量服用谷氨酰胺可增加GSH的合成，GSH的增加促进了PPARα表达增加，最终降低了肝脏炎性反应。

综上所述， L-谷氨酰胺可显著降低IR，进而降低大鼠SREBP- 1和ACCα mRNA和蛋白表达，增加PPARα mRNA和蛋白表达，最终缓解了非酒精性脂肪肝病症状。

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[3] Badole SL, Bagul PP, Mahamuni SP,etal.Oral L-glutamine increases active GLP- 1 (7-36) amide secretion and improves glycemic control in stretpozotocin-nicotinamide induced diabetic rats[J].Chem Biol Interact, 2013,203:530- 541.

[4] Farrrll GC, Chitturi S, Lau CK,etal. guidelines for the assessment and management of nonalcoholic fatty liver disease in the Asia-Pacific region:executive summary[J].J Gastroenterol Hepatol, 2007,22:775- 777.

[5] Kotzka J, Müller-Wieland D.Sterol regulatory element-binding protein (SREBP)- 1: gene regulatory target for insulin resistance?[J].Expert Opin Ther Targets, 2004,8:141- 149.

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降低尿酸有利于减少痛风并发症

据美国WebMD医学新闻网2013-11-15报道，有研究显示，相较于没有治疗的患者，持续进行降尿酸治疗的痛风患者不易发生导致慢性肾病的肾脏损伤。

研究者检视了Kaiser Permanente数据库中血清尿酸值大于70 mg/L的111 992名患者，其中16 186名在参与研究前的6个月内曾经检查过至少1次的血清尿酸值与肾小球过滤速率，在追踪期间至少进行1次。

从这些患者第1次纪录有高血清尿酸值后追踪36个月，分成以下几类：未曾使用降尿酸治疗、使用降尿酸治疗的时间不到80%及使用降尿酸治疗的时间超过80%。

所有接受治疗的患者几乎都有使用别嘌呤醇(allopurinol)(98.3%)。

Levy医生表示，达到ACR指引的血清尿酸值低于60 mg/L是具有保护性的，与肾脏方面结果改善37%有关，这些患者代表的是实际情况。

生物钟不规律影响免疫系统

据英国《BBC新闻》(BBC NEWS)2013-11-21报道，一项新的研究认为，人体作息一旦违反生物钟，将导致免疫系统受到牵连。

达拉斯得克萨斯大学西南医学中心的免疫学家劳拉·胡珀(Lora Hooper)和她的同事专注于研究NFIL3，这是一种负责引导免疫细胞成长的蛋白质。她们发现患有肠炎的小鼠体内中的NFIL3基因发生突变，导致负责免疫的T细胞转变成更多的TH17细胞。

Hooper尝试把实验室培育的T细胞中的NFIL3水平增高，发现转变成TH17的细胞减少了。于是，她认为这种蛋白质的作用是预防T细胞转变成TH17。缺少这种蛋白质将导致免疫细胞TH17活跃性失控、数量大增。TH17原本负责对抗细菌和真菌感染，数量多了则会导致疾病。

研究结果在最后一次的实验中更加具体化。研究员改变了小鼠的倒时差，也就是把其昼夜的周期每4天改掉6 h，这就如同从美国飞到欧洲、印度和日本，并在每个国家住4 d。研究结果发现，被更改过的小鼠的肠和脾脏中的TH17数量是正常昼夜循环的2倍。这些体内生物钟被颠倒的小鼠在接受化学实验的刺激下，其炎性反应更强烈。

Hooper表示，这项研究显示了健康规律的作息对平衡免疫系统是非常重要的。她透露，炎性反应是许多慢性疾病的起因，如心脏病、哮喘和慢性疼痛等。

这项研究刊登在2013年11月的《科学》(Science)杂志。

L-glutamine being used to treat non-alcoholic fatty liver disease in rats

ZHANG Li1, NIU Shi-wei1，3, LI Xiao-bo1, LIU Hua1, HUANG Hong1, LI Yan1*, LI Shu-de2*

(1.the First People’s Hospital in Yunnan Province, Kunming 650032；2.School of Basic Medicine, Kunming Medical University, Kunming 650504；3.School of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology, Kunming 650504, China)

ObjectiveTo observe the effect of L-glutamine on fat-induced nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) in rat.MethodsRats were randomly divided into control group, model group and L-glutamine treatment group. Build nonalcoholic fatty liver disease model after the high-fat diet in model group and L-glutamine treatment group. The appropriate treatment was given in modeling, rats were sacrificed after 8 weeks treatment to detect relevant indicators.ResultsCompared with the model group, liver pathology profile in treatment group alleviated, fat vacuoles reduced; LDL, AST, TBA CHOL, TG, LDL-C, IL- 6, TNF-α, IL- α, IL- β, MDA and CRP was significantly lower(P<0.05); GSH, T-AOC, HDL-C was significantly higher (P<0.05);SREBF1andACCαmRNA and protein expression was significantly decreased (P<0.05),PPARαmRNA and protein expression was significantly increased(P<0.05).ConclusionsL-glutamine can alleviate the symptoms of nonalcoholic fatty liver disease in rats, the mechanism may be reducing SREBF1 and ACCα expression, while

non-alcoholic fatty liver disease; L-glutamine; liver function; peroxisome proliferator activated receptor alpha; acetyl-CoA carboxylase alpha; sterol regulatory element binding transcription factor 1

2014- 11- 13

：2015- 02- 02

云南省科技厅-昆明医科大学联合专项(2011FB225)；云南省应用基础研究 (2013FZ183)；云南省第一人民医院王陇德院士工作站基金(2013年)；云南省老年病防治研究中心基金(2014NS240)

*通信作者(correspondingauthor)：689963575@qq.com; shudeli006@vip.sina.com

1001-6325(2015)05-0642-05

研究论文

R965.1

：A

promoting PPARα expression achieved.

、美国加州Downey Kaiser Permanente医疗团队风湿科的Gerald Levy医生向出席美国风湿科学院(ACR)2013年会的记者表示，南加州的Kaiser Permanente约有360万人，这之中有相当多肾病患者，有一些研究显示，肾病患者会发生高尿酸血症，有些也会发生痛风，我们想要了解逆转尿酸血症是否对肾病有所影响。