组培铁皮石斛多糖对自由基清除作用的研究

唐军荣，刘云，董燕平（西南林业大学国家林业局西南地区生物多样性保育重点实验室，云南昆明650224）

组培铁皮石斛多糖对自由基清除作用的研究

唐军荣，刘云，董燕平
（西南林业大学国家林业局西南地区生物多样性保育重点实验室，云南昆明650224）

摘要：采用水提法从组培铁皮石斛中提取出多糖，研究组培铁皮石斛中多糖对自由基的清除作用。结果表明：组培铁皮石斛中多糖具有较强的抗氧化能力，对羟基自由基、超氧阴离子自由基和1，1-二苯基-2-苦基苯肼自由基（DPPH·）均具有良好的清除作用。当多糖质量达到60 μg时，其对羟基自由基清除率能达到91.4%，对超氧阴离子自由基的抑制率最高达47.08%；当多糖质量达到700 μg时，对DPPH·的清除率达到51.91%。因此，组培铁皮石斛中多糖具有较强的清除自由基的作用。

关键词：组培铁皮石斛；多糖；自由基；清除作用

铁皮石斛（D.candidum Wall.ex Lindl.）是兰科石斛属（Dendrobium）多年生附生草本植物[1]，是《中华人民共和国药典》收载的5种石斛属植物之一，主伤中、除弊、下气、补五脏虚劳羸弱、强阴、久服厚肠胃；民间称其为“救命仙草”[2]。多糖是石斛属植物的主要活性成分[3]，石斛多糖具有降血糖[4]，抗肿瘤[5]，抑菌[6]等功效。人工培养铁皮石斛中含有丰富的蛋白质和氨基酸，并含有丰富的K、Ca、Mg等无机元素，具有较高的营养价值[7]。

采用组培铁皮石斛苗作为材料，以组培铁皮石斛苗中提取出的多糖为主要研究对象，对照组培铁皮石斛苗和VC进行总还原能力、清除羟基自由基、清除超氧阴离子和清除DPPH·（1，1-二苯基-2-苦基苯肼自由基）能力进行测定。拟阐明这些不同样品的抗氧化性以及清除自由基的作用效果，为进一步阐明组培铁皮石斛苗中多糖抗氧化稳定性的机制、开发功能性食品、药品、保健品提供理论参考，从而进一步推进铁皮石斛人工培养物在功能食品和药品中的应用。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

组培铁皮石斛苗：为云南省文山州种源。

葡萄糖（C6H12O6）、蒽酮、三吡啶三吖嗪（TPTZ）、维生素C、水杨酸、盐酸、醋酸钠、三氯化铁、硫酸亚铁、双氧水、水杨酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、邻苯三酚、硫酸、DPPH、甲醇等，均为分析纯。

1.2主要仪器、设备

UV-1000紫外可见分光光度计：北京莱伯泰科仪器有限公司；N1100D-W旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D（Ⅲ）真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；3K15台式冷冻高速离心机：德国SIGMA公司。

1.3方法

1.3.1组培铁皮石斛中多糖的提取

将铁皮石斛组培苗破碎，破碎的石斛组织于90℃、料水比1∶20的条件下回流提取1 h，重复3次，合并提取液，3 000 r/min下离心5 min，收集上层离心液，经真空浓缩，干燥后称重，得待测样品，避光保存备用。

1.3.2组培铁皮石斛多糖含量的测定

1.3.2.1葡萄糖标准曲线的绘制

精密称取经105℃干燥恒重的标准葡萄糖0.05 g（精确到0.0001g），用温蒸馏水溶解，并定容至1000mL。此溶液质量浓度为50 μg/mL。分别取上述葡萄糖溶液0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL到25 mL具塞试管中，用蒸馏水补足到2 mL；在冰水浴中加入4 mL的2 g/mL的蒽酮-硫酸溶液，摇匀，置于沸水中加热煮沸5 min，取出后用流动水冷却至室温，以零管为空白，于625 nm处测定吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，对应吸光值为纵坐标建立标准曲线，如图1所示。

图1　葡萄糖标准曲线Fig.1　The standard curve of glucose

1.3.2.2组培铁皮石斛多糖含量的测定

取样品的储备液（50 μg/mL）1.6 mL到25 mL具塞试管中，用蒸馏水补足到2 mL；在冰水浴中加入4 mL 的2 g/mL的蒽酮-硫酸溶液，摇匀，置于沸水中加热煮沸5 min，取出后用流动水冷却至室温，以葡萄糖样品中零管为空白，于625 nm处测定吸光度。由标准曲线求得对应的多糖浓度，以葡萄糖计。

1.3.3FRAP法测定组培铁皮石斛多糖的总抗氧化能力[8]

1.3.3.1硫酸亚铁标准曲线的绘制

FRAP工作液的配制：用40 mmol/L盐酸溶液溶解，配成1.6 mmol/LTPTZ，配制pH3.6的醋酸盐缓冲液300 mmol/L和20 mmol/L FeCl3溶液。3者以1∶100∶1的比例混合配成工作液。

取不同体积5 μL～140 μL的1mmol/L FeSO4溶液，用蒸馏水补足至2mL，再加入配制好的FRAP工作液3 mL，混匀后于37℃反应30 min，在593 nm下测定样品液的吸光度值，确定还原力标准曲线，如图2所示。

图2 还原力标准曲线Fig.2　The standard curve of reduntion force

1.3.3.2组培铁皮石斛多糖总抗氧化能力的测定

精密称取样品质量50 μg～300 μg的待测样品加入到有刻度试管中，加蒸馏水至2 mL，再加入FRAP工作液3 mL，混匀后于37℃反应30 min，取出后立即在593 nm处测定吸光度。以不加样品组为参照，测定样品吸光度值，每个样品平行测3次，取平均值。根据还原力标准曲线，计算相同吸光度值的FeSO4当量浓度，记为FRAP值。

1.3.4组培铁皮石斛多糖清除羟基自由基的能力

根据Fenton反应的方法，建立·OH产生体系模型。采用固定反应时间法，并与无·OH的空白组比较，便能测定被测物·OH的清除能力[9]。在刻度试管中加入5mL的蒸馏水，30 μL的0.02mol/L的FeSO4，100 μL 0.01 mol/L水杨酸，最后加入25 μL 0.02 mol/L H2O2启动反应，放置37℃水浴保温反应30 min，之后立即在510 nm处测定吸光度，作为空白吸光度值。同上，在刻度试管中分别加入不同系列5 μg～60 μg的样品后，再加入25 μL 0.02 mol/L H2O2启动反应，水浴恒温30min，之后测定吸光度值作为加样品后吸光度值[10]。

清除率/%=[（A1-A0）/A0]×100

式中：A1为加入待测物后的吸光值；A0为空白对照的吸光值。

1.3.5组培铁皮石斛多糖抑制超氧阴离子自由基的能力

以改良邻苯三酚自氧化的速率来表示抑制超氧阴离子自由基的能力[11]

加入样品前：将pH8.2Tris-HCl缓冲液和50mmol/L邻苯三酚在25℃的恒温水浴锅中保温，取5 mLpH 8.2Tris-HCl缓冲液，加30 μL 50 mmol/L邻苯三酚，摇匀，在325 nm下立即测定。以pH8.2Tris-HCl缓冲液为空白，每隔0.5分钟测一次吸光值，计算出平均值A0。

加入样品后：取5 mL pH8.2Tris-HCl缓冲液，加待测样品5 μg～60 μg、30 μL 50 mmol/L邻苯三酚，摇匀，立即同上测定。以pH8.2Tris-HCl缓冲液为空白，每隔0.5 min测一次吸光值，计算出平均值A1。

抑制率/%=[（A0-A1）/A0]×100

式中：A1为加入待测物后的吸光值；A0为空白对照的吸光值。

1.3.6组培铁皮石斛多糖清除DPPH自由基的能力[12]

1.3.6.1DPPH标准曲线的绘制

精密称取DPPH0.020 2 g，加甲醇溶解，定容至50 mL，作为储备液。精密移取上述储备液10 mL至100 mL容量瓶中，定容得40.4 mg/L的储备液，备用。分别精密移取DPPH储备液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL于10 mL刻度试管中，用甲醇定容至刻度，摇匀，以甲醇溶剂作参比，在515 nm处测定各溶液的吸光度。以DPPH的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，如图3所示。

图3DPPH标准曲线Fig.3　The standard curve of DPPH

1.3.6.2组培铁皮石斛多糖清除DPPH自由基的能力

分别在1.0 mL DPPH储备液中加入不同质量（200 μg～800 μg）样品待测物，用甲醇稀释至总体积为3.00 mL，混匀放置40 min后，用1 cm比色皿于515 nm处测定吸光度，根据DPPH标准曲线回归方程计算DPPH质量浓度，按下列公式计算DPPH·清除率（Y）。

式中：C0为反应体系中DPPH的起始质量浓度，mg/L；Ct为40min后反应体系中DPPH的质量浓度，mg/L。

2　结果与分析

2.1组培铁皮石斛多糖的含量

经过测定，由水提取法浸提组培铁皮石斛苗，所得到的组培铁皮石斛多糖及组培铁皮石斛苗中多糖的含量分别为73.15%和10.51%。

2.2组培铁皮石斛多糖的总抗氧化能力

通过FRAP法，3种不同样品总抗氧化的能力见图4所示。

图4FRAP法测定不同样品的还原力Fig.4　The reduction force of different samples determined by FRAP method

由图4可知，当样品加入量在50 μg～300 μg范围时，随着组培铁皮石斛多糖、组培铁皮石斛苗及VC加入量的增加，其总抗氧化的能力也随之增强。组培铁皮石斛苗的抗氧化能力最弱，组培石斛多糖抗氧化能力相对较强，而VC的总抗氧化能力优于组培铁皮石斛苗。总体说来组培铁皮石斛多糖的总抗氧化能力明显比组培铁皮石斛苗强得多。

2.3组培铁皮石斛多糖清除羟基自由基的能力

依据Fenton反应体系建立的清除羟基自由基能力，其结果如图5所示。

图5 不同样品对·OH清除作用Fig.5　The scavenging effects to·OH with different samples

由图5可知，组培铁皮石斛多糖对羟基自由基清除能力高于其余样品，VC对羟基自由基清除能力相对较低，而组培铁皮石斛苗对羟基自由基清除能力最低。由此可知，组培铁皮石斛多糖对羟基自由基清除能力较高，而组培铁皮石斛苗对羟基自由基清除能力相对较弱。

2. 4组培铁皮石斛多糖抑制超氧阴离子能力

不同样品抑制超氧阴离子能力如图6所示。

由图6可知，3种不同物质都具有一定的抑制超氧阴离子自由基的能力。随着样品含量的增加，样品抑制超氧阴离子自由基的能力不断增强。组培铁皮石斛苗抑制超氧阴离子自由基的能力相对较弱，当样品加量为10 μg时，对超氧阴离子自由基的抑制率仅为3.48%，加样量增大到60μg时，抑制率也仅为23.47%；组培铁皮石斛多糖抑制超氧阴离子自由基能力相对较强，即当样品质量均增加到60 μg时，组培铁皮石斛多糖抑制超氧阴离子自由基能力达到了47.08%，VC次之，抑制超氧阴离子自由基能力达到了44.19%。

图6　不同样品对·O2-抑制作用Fig.6　The inhibition effects to·O2-with different samples

2.5组培铁皮石斛多糖清除DPPH自由基的能力

组培铁皮石斛多糖清除DPPH自由基的能力见图7。

图7不同样品对DPPH·的清除作用Fig.7　The scavenging effects to DPPH·with different samples

由图7可知，随着反应体系中加入组培铁皮石斛多糖、组培铁皮石斛苗及VC的质量愈大，其清除DPPH自由基的能力愈强。对不同样品物质所表现出来的清除DPPH自由基的能力有所不同。试验结果表明，组培铁皮石斛多糖清除DPPH自由基的能力相对较强，当石斛多糖质量为700 μg时，组培铁皮石斛多糖清除率达到51.91%，而其他两个样品对DPPH·的清除率效果均低于组培铁皮石斛多糖。

3　结论

试验结果表明，与组培铁皮石斛苗和VC相比较，组培铁皮石斛苗经水提法浸提得到的组培铁皮石斛多糖具有较强的总抗氧化能力及羟基自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的清除能力，且均是随着多糖质量的增大而增强。当组培铁皮石斛加入质量达到60 μg时，对羟基自由基的清除率达到91.40%；当组培铁皮石斛加入质量达到10 μg以上时，对超氧阴离子自由基的抑制率达到22.12%以上；当组培铁皮石斛加入质量增大到700 μg时，对DPPH自由基的清除率达到51.91%。可见，组培铁皮石斛多糖具有较强的清除自由基的作用。

参考文献：

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.004

收稿日期：2014-03-17

基金项目：云南省教育厅科学研究基金（2013Y123）

作者简介：唐军荣（1982—），男（汉），讲师，硕士，主要从事药用植物的繁育研究。

Study on the Free Radicals Scavenging Effects of Polysaccharides in Tissue Culturing Seedlings of Dendrobium Candidum

TANG Jun-rong，LIU Yun，DONG Yan-ping
（Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest China of State Forestry Administration，Southwest Forestry University，Kunming 650224，Yunnan，China）

Abstract：Water extraction method was used to extract polysaccharides from tissue culturing seedlings of Dendrobium Candidum，and the scavenging effects of polysaccharides in tissue culturing seedlings of Dendrobium Candidum on free radicals were studied.The results indicated that polysaccharides extracted from tissue culturing seedlings of Dendrobium Candidum had remarkable antioxidative activity，and exhibited satisfactory scavenging effects on·OH and·O2-and DPPH·.The scavenging rates on·OH and·O2-were 91.4% and 47.08%when polysaccharides quality was 60 μg；the scavenging rates on DPPH·was 51.91%when polysaccharides quality was 700 μg.The ability of free radicals scavenging of polysaccharides in tissue culturing seedlings of Dendrobium Candidum was good.

Key words：tissue culturing seedlings of Dendrobium Candidum；polysaccharides；free radical；scavenging effects