树莓干果总黄酮纯化前后活性比较

杨静，武彦辉，刘缘晓，韩红娟，许娇妹，刘永平，*（.中北大学化工与环境学院，山西太原03005；2.北京农学院农业部都市农业（北方）重点实验室，北京02206）

树莓干果总黄酮纯化前后活性比较

杨静1，2，武彦辉1，刘缘晓1，韩红娟1，许娇妹1，刘永平1，*
（1.中北大学化工与环境学院，山西太原030051；2.北京农学院农业部都市农业（北方）重点实验室，北京102206）

摘要：用超声辅助醇法提取的树莓干果总黄酮，再经XDA-6大孔树脂纯化，比较纯化前后药粉中黄酮含量、抗氧化活性、抑菌活性以及菌丝生长抑制率的变化。结果显示：在50%乙醇溶解条件下，纯化后黄酮含量比纯化前提高了91.10%；在纯化前后药液浓度均为0.25 mg/mL时，DPPH抗氧化活性提高最多，达到13.35%；大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度从纯化前的药液浓度8 mg/mL（相当于黄酮浓度1.6 mg/mL）下降为药液浓度2 mg/mL（相当于黄酮浓度0.8 mg/mL）；纯化前后黄酮对小麦赤霉菌和棉花枯萎菌的菌丝抑制率表现为低浓度下提高多，高浓度下提高少的趋势，药液浓度为8 mg/mL时，对棉花枯萎菌抑菌率提高幅度最小为0.6%，而药液浓度为1 mg/mL时，对小麦赤霉菌抑菌率提高幅度最大为44.02%，说明大孔树脂纯化后黄酮的各项指标有所改善。

关键词：树莓；黄酮；抗氧化活性；抑菌活性；菌丝生长抑制率

树莓（Rubus idaeus）是蔷薇科（Rasaceae）悬钩子属（Rubus）植物，又名马林果，覆盆子，悬钩子、托盘等，为多年生小灌木，兼木草两性。树莓果实柔嫩多汁、酸甜适口，尤其富含黄酮、VC、VE、鞣花酸、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）等多种抗炎、抗衰活性物质，被美国人称为“生命之果[1]。树莓品种众多，根状茎发达，适应性强，成活率高，最高可耐受我国东北和新疆地区-20℃至-40℃低温，适合在多地推广种植[2]。

树莓鲜果采收期集中，果实易腐易衰，必须及时冷冻储藏，而树莓干果、果粉和其中有效成分的研究开发将减少对冷库和快速消费市场的依赖，有利于开拓树莓的应用前景。树莓干果可药食两用，其中的黄酮含量较高，有很好的抗氧化活性和抑菌活性，具有很高的研究价值[3]。黄酮类化合物（flavonoids）又称黄酮体、黄碱素，是高等植物所产生的一大类代谢次级产物，多年来一直是国内外开发研究的热点，目前已知5 000种，基本骨架为C6-C3-C6[3]。

1　材料和方法

1.1材料

树莓干果：购于太原市仁和大药房，80℃烘干，家用万能粉碎机粉碎至300 μm～400 μm备用；样品成分分析中所用化学试剂均为分析纯或生化试剂。

UV-9600紫外可见分光光度计：北京瑞利分析仪器公司；JOYN-15AL超声仪：上海乔跃电子有限公司；RE-5203旋转蒸发仪：上海亚荣仪器厂；SHZ-D（III）循环水式真空泵：巩义予华仪器有限责任公司。

1.2菌种

大肠杆菌（Eschrichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcu aureus）、棉花枯萎菌（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum）、小麦赤霉菌（Fusarium graminearum）：由中北大学生物质能源实验室保存。

1.3试验方法

1.3.1树莓干果黄酮的提取纯化

称取粉碎后树莓干果粉末50 g于300 W超声波仪中，加入500 mL52%乙醇于50℃下进行超声辅助提取，提取时间45 min，重复提取1次，合并滤液真空旋蒸，静置沉淀后取上清；一部分干燥得到黄色粉末，记为粗黄酮[4]；另一部分药液经XDA-6大孔树脂纯化，经真空旋蒸干燥后得到的黄色粉末，记为纯黄酮。

1.3.2纯化前后黄酮含量的测定

式中：n为稀释倍数；C为溶液中总黄酮浓度，mg/ mL；V为溶解体积，mL；m为粗黄酮药粉重量，mg。

1.3.3抗氧化活性的测定

式中：A样品表示试验样品对DPPH作用的吸光度；A空白表示试验样品自身对吸光度的贡献；A对照表示DPPH本身在测定波长处的吸收度。

1.3.4培养基的配制

用1.3.2中黄酮含量最高的乙醇浓度配制80mg/mL母液，二倍稀释后适量添加到无菌培养中，配制①LB液体培养基+粗黄酮（药粉终浓度：0、1、2、4、8 mg/mL）；②LB液体培养基+纯黄酮（药粉终浓度：0、0.5、1、2 mg/mL）；③PDA固体培养基+粗黄酮（药粉终浓度：0、1、2、4、8 mg/mL）；④PDA固体培养基+纯黄酮（药粉终浓度：0、1、2、4、8 mg/mL）。

1.3.5最低抑菌浓度的测定

分别接种200 μL经活化的细菌（稀释到浓度为1×106cfu/mL）于含有不同浓度黄酮药粉的20 mL LB液体培养基中，用未加菌液的培养基作为每组的空白对照，每培养2 h吸取0.5 mL培养液，稀释后（大肠杆菌稀释4倍，金黄色葡萄球菌稀释10倍），平行测定3组A600nm值，考虑到测定中的体积影响，每测4个点，更换一瓶，37℃下培养24 h，观察记录，不长菌的最高药粉浓度为最低抑菌浓度。

1.3.6真菌菌丝抑菌率测定

用6 mm内径的打孔器将活化好的菌落打孔取样（3块/皿），菌丝朝下放置于含有不同浓度黄酮药粉的PDA固体培养基上，28℃下倒置培养48 h后测量菌丝长度：

2　结果与分析

2.1不同乙醇浓度下纯化前后黄酮含量变化

红树莓鲜果的营养价值丰富，除了含有多种人体所需的营养元素，还含有抗炎、抗衰和抗癌的黄酮、水杨酸等多种次生代谢物。其中黄酮的种类繁多，溶解度因结构及存在状态（苷或苷元，单糖苷，双糖苷或三糖苷）不同而有很大差异。以不同乙醇浓度溶解纯化前后黄酮药粉，经比色法测定发现总黄酮含量随乙醇浓度提高发生有规律的变化，结果见图1。

图1　不同乙醇浓度下纯化前后黄酮含量变化Fig.1　Flavonoids content before and after purification at different concentration of ethanol solution

由图1可知，随着乙醇浓度的不断增加，纯化前后黄酮药粉的溶解度呈现出先升高再降低的趋势，在50%乙醇浓度处溶解度最高，含量分别达到粗黄酮21.12%，纯黄酮的40.36%，纯度大约提高了91.10%，即1 mg/mL的粗黄酮药粉溶液相当于有效黄酮浓度约为0.2 mg/mL，而1 mg/mL的纯黄酮药粉溶液则相当于有效黄酮浓度约为0.4 mg/mL；另外，纯化后药粉的黄酮含量始终高于纯化前药粉的含量。

树莓果期集中，果实常温下几个小时就会失去商品价值，是最不耐保存的水果之一。就是在-18℃条件下，随着贮藏时间延长汁液流失率升高，硬度下降，花色素苷、总酚含量也逐渐下降[5]。干燥保存不仅有利于易腐水果的保存，也不利于对其提取物的保存和运输。树莓干果醇提后的药液经过旋蒸浓缩后，溶剂乙醇含量低于5%，低温保存也容易长菌变质；纯化后的药液用60%的乙醇浓缩近一倍，但是体积较大，所以纯化前后的药液干燥成粉是一种有效的保存、运输和再利用的方法。但是不同干燥方式也可能导致不同的组分流失，Si等[6]研究了不同的干燥方法对于树莓果实不同次生代谢的保存效果差异，结果显示冷冻干燥最有利于水提花色素的保留，而热风干燥结合红外微波干燥法则最有利于多酚和黄酮的保留。因此根据不同的使用目的，探讨研究树莓的保存方式，有利于树莓推广和产业发展。

2.2纯化前后黄酮抗氧化活性变化

将纯化前后黄酮药粉分别配制和稀释成浓度为0.05、0.10、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL溶液，通过DPPH抗氧化活性检测结果见图2。

图2　纯化前后黄酮抗氧化活性变化Fig.2　Flavonoids antioxidant activity changes before and after purification

由图2可知，纯化前后药粉浓度为2.0 mg/mL时，氧自由基清除率均超过90%，接近饱和，且它们之间差异不显著（P<0.05）。但是，在其它被测浓度范围内，均表现为纯化后的氧自由基清除率高于纯化前的，差异最大值为0.25 mg/mL时，纯化前为76.58%，纯化后为86.81%，提高了13.35%；但是根据2.1的结果，50%乙醇溶解下，黄酮的纯度提高了91.10%，远高于抗氧化活性的提高，这可能是由于醇提产物中其它物质参与了氧自由基的清除，而大孔树脂的纯化并没有相应的富集这些物质。检测发现粗黄酮总蛋白的含量从（64.94±1.76）mg/g升高到纯黄酮的（73.12± 0.92）mg/g，而SOD的比活则从（79.24±2.48）U/mg下降到（68.11±0.27）U/mg。

2. 3纯化前后黄酮对细菌抑菌活性的影响

在不含黄酮的LB培养基中，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌正常生长，经过24 h的培养，A600 nm值接近1.0，而在含有不同药粉浓度培养基中，两种细菌的生长都受到了不同程度的抑制，结果见图3。

如图3A、图3C显示两种细菌的粗黄酮最小抑菌浓度MIC为8 mg/mL，相当于有效黄酮浓度为1.6 mg/mL；如图3B、图3D显示，纯黄酮药粉的最小抑菌浓度MIC为2 mg/mL相当于有效黄酮浓度为0.8 mg/mL，也就是在纯化后黄酮含量增加约1倍的情况下，抑菌活性提高了2倍，说明大孔树脂纯化对这两种细菌的抑菌组分得到了更好的富集。在细菌培养中还发现：高浓度的粗黄酮药粉浓度（特别是8 mg/mL）由于杂质和颗粒存在，随着培养时间的延长对吸光值有少量影响，但是几乎保持恒定，未见细菌生长；而纯黄酮药粉易溶解，无杂质沉淀，全程不影响吸光值。

图3 纯化前后抑菌活性比较Fig.3 Comparison of antibacterial activity of flavonoids before and after purification

2.4纯化前后黄酮对真菌抑菌活性的影响

小麦赤霉菌（又名禾谷镰刀菌）和棉花枯萎菌是危害小麦和棉花正常生长的真菌，黄酮添加对真菌菌丝生长的抑制作用见图4。

图4　粗黄酮和纯黄酮对真菌菌丝的抑菌率比较Fig.4　Comparison of hyphae inhibition rate of flavonoids before and after purification

由图4可知，纯化前后不同浓度黄酮添加都能抑制菌丝生长，并且随着药液浓度的增加对真菌菌丝的抑制作用不断加强；粗黄酮和纯黄酮对小麦赤霉菌的抑菌活性总体上比棉花枯萎菌的高；纯黄酮抑菌活性略高于粗黄酮，但是这种差异在两种真菌中都表现为随着药液浓度增加，差异逐渐减少的趋势。最接近的一组是8 mg/mL的棉花枯萎菌，纯化前抑制率为57.41%和纯化后的58.78%，虽然统计学上差异显著（P<0.05），但是数值上仅仅提高了0.6%；差异最大一组是1 mg/mL的小麦赤霉菌，纯化前为20.38%，纯化后是30.00%，抑制率提到了44.02%。但是，纯黄酮对于真菌抑菌活性的提高远低于纯黄酮对细菌抑菌活性的提高（提高了2倍，即200%）。推测由于黄酮种类众多，大孔树脂可能对抑制真菌的黄酮组分没有有效富集，也有可能是粗黄酮药粉中的其他可溶性物质参与了真菌菌丝的生长抑制。在番石榴中提取番石榴苷（一种植物黄酮）对造成龋齿的变性链球菌有很好的抑制作用[7]，而且在不同种植物、不同品种、甚至同一品种的不同采收期所含有的黄酮种类和成分差异巨大[8-9]，因此，进一步借助HLPC和层析技术分析、富集树莓果实中的不同黄酮成分，进行更有针对性的研究，可能是解释纯化前后黄酮药粉各项指标变化的内在原因。

3　结论

纯化后的黄酮药粉杂质更少，溶解液更加澄清，含量从纯化前的21.12%提高到纯化后的41.36%，纯度约增加1倍；DPPH抗氧化活性在药粉浓度为0.25 mg/mL时提高最大，提高了13.35%；大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度MIC从粗黄酮的8 mg/mL（黄酮浓度1.6mg/mL）下降到纯黄酮的2mg/mL（黄酮浓度0.8 mg/mL），抑菌活性提高了2倍；纯化后黄酮对小麦赤霉菌和棉花枯萎菌的菌丝抑制率表现为低浓度下提高多，高浓度下提高少的趋势，药液浓度为8 mg/mL时，对棉花枯萎菌抑菌率提高幅度最小为0.6%，而药液浓度为1 mg/mL时，对小麦赤霉菌抑菌率提高幅度最大为44.02%，但是真菌菌丝抑制效率的提高远远低于对细菌的抑制效率的提高幅度。

参考文献：

[1]Medda R,Lyros O,Schmidt JL,et al.Anti inflammatory and anti angiogenic effect of black raspberry extract on human esophageal and intestinal microvascular endothelial cells[J].Microvasc Res,2015 (97):167-180

[2]房琳琳,赵余庆.树莓的现代药学及生物活性研究进展[J].沈阳药科大学学报,2014,31(1):74-80

[3]游庭活,刘凡,温露,等.黄酮类化合物抑菌作用研究进展[J].中国中药杂志,2013,38(21):3645-3650

[4]杨静,王茜,韩红娟,等.树莓黄酮提取工艺的响应面法和正交法比较[J].食品研究与开发,2015,36(18):101-105

[5]刘畅,孟宪军,孙希云,等.不同树莓品种冻藏品质变化及适宜冻藏品种筛选[J].食品工业科技,2014,35(20):354-357

[6]Si X,Chen Q,Bi J,et al.Comparison of different drying methods on the physical properties,bioactive compounds and antioxidant activity of raspberry powders[J].J Sci Food Agric,2015,doi:10.1002/jsfa. 7317

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[9]Sariburun E,Sahin S,Demir C,et al.Phenolic co ntent and antioxidant activity of raspberry and blackberry cultivars[J].J Food Sci, 2010,75(4):328-335

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.001

收稿日期：2015-08-31

基金项目：国家自然科学青年基金（31200462）；山西省自然科学青年基金（2012021029-1）；北京农学院农业部都市农业（北方）重点实验室开放课题（KFK2015001）；大学生创新创业课题（2014-2016）

作者简介：杨静（1977—），女（白），副教授，博士，研究方向：植物生理生化。

*通信作者

Comparison Activity of Total Flavonoids from Raspberry Dry Fruit before and after Purification

YANG Jing1，2，WU Yan-hui1，LIU Yuan-xiao1，HAN Hong-juan1，XU Jiao-mei1，LIU Yong-ping1，*
（1.School of Chemical Engineering and Environment，North University of China，Taiyuan 030051，Shanxi，China；2.Key Laboratory of Urban Agriculture（North）of Ministry of Agriculture P.R.China，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China）

Abstract：Total flavonoids were extracted by auxiliary ultrasonic-assisted alcohol method from raspberry dry fruit，then purified through macroporous resin XDA-6.Comparison qualities of the unpurified and purified flavonoids powder include the purity，antioxidant activity，antibacterial activity and hyphae inhibition rate. Results showed that the purity of purified flavonoids dissolved by 50%alcohol increased by 91.10%，antioxidant activity of purified flavonoids increased by 13.35%at 0.25 mg/mL.The minimum inhibitory concentration（MIC）of Escherichia coli and Staphylococcus aureus droped to purified solution concentration of 2 mg/mL（the equivalent of flavonoid concentration of 0.8 mg/mL）from unpurified solution concentration of 8 mg/mL（the equivalent of flavonoid concentration of 1.6 mg/mL）.The differences of hyphae inhibition rate of flavonoids before and after purification were higher under low concentrations than under high concentrations. The minimum difference of inhibition rate of Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum was 0.6%at 8 mg/mL，while the maximum difference of inhibition rate of Fusarium graminearum was 44.02%at 1 mg/mL.Therefore，the qualities of purified flavonoids were improved after purification.

Key words：raspberry；flavonoids；antioxidant activity；antibacterial activity；hyphae inhibition rate