NGAL在肾小管上皮细胞缺氧-复氧损伤中的作用及机制探讨

康文龄

NGAL在肾小管上皮细胞缺氧-复氧损伤中的作用及机制探讨

康文龄

目的 探讨中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白在大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）缺氧-复氧(H/R)损伤中的作用及机制。方法 体外培养NRK-52E，构建细胞H/R模型，将细胞分为4组：正常对照组、H/R组、H/R +pcDAN3.1空载组、H/R+pcDAN3.1-NGAL组。结果 H/R组细胞相比正常对照组，凋亡率显著增加（P＜0.05），细胞生长受受抑制（P＜0.05）。和H/R组进行对比，可发现H/R+pcDAN3.1-NGAL组细胞凋亡率明显降低，G1期细胞所占的比例明显下降，S期细胞所占的比例明显增多，整体细胞量出现显著的增殖现象，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论 NGAL可通过促进肾小管上皮细胞增殖，抑制H/R诱导的细胞凋亡，在H/R损伤中发挥保护作用。

NGAL；缺血/再灌注损伤；肾小管上皮细胞；细胞凋亡；内质网应激

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白是kjeldsen L等1993年在中性粒细胞特异性颗粒中发现的一种25Kd的小分子分泌型蛋白[1]。众多研究表明，急性肾损伤发生时，肾小管上皮分泌的NGAL显著增加，可作为AKI早期诊断及预后预测重要标志物[2]，但有关NGAL生物学功能尚不明确，本实验通过建立大鼠肾小管上皮细胞缺氧-复氧(H/R)模型，探讨NGAL在肾小管上皮细胞缺血/复氧损伤中的作用及其相关机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 HEPA—CLASS100三气组织培养箱（美国Thermo公司），大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)（美国ATCC公司），pcDNA3.1空载及pcDAN3.1-NGAL质粒由本实验室制备；胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培养基（美国

Gibco公司），二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma公司），3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）（北京索莱宝科技有限公司），细胞周期检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）。

1.2 细胞培养及分组 从液氮罐中取出冻存的NRK-52E细胞，37℃的水浴迅速解冻后吸出细胞悬液，加入10倍体积采用含10%FBS的DMEM、100mg/mL链霉素和100mg/ mL青霉素的培养基混匀，1000r/min，离心5min，弃上清，重复洗涤1次后将细胞悬液稀释混匀，37℃、5%CO2培养箱中培养，当细胞融合度达90%的细胞时，加入无血清培养基同步化12h，进行试验[3-4]。将培养的NRK-52E细胞分4组：正常对照组；缺血/缺氧模型组（H/R组）；缺血/缺氧模型+pcDAN3.1空载组（H/R+pcDAN3.1空载组）；缺血/缺氧模型+pcDAN3.1-NGAL组（H/R+pcDAN3.1-NGAL组）。

1.3 pcDNA3.1-NGAL构建及鉴定 提取出生1周内的C57小鼠脾脏RNA，逆转录后得到NGAL cDNA，PCR扩增纯化，并与载体pcDNA3.1/HisA用Acc65I 和EcoR1进行双酶切，回收酶切产物后在T4DNA连接酶作用下进行连接，将连接产物转化入DH5a感受态细菌中,在Amp平板上筛选培养，37℃过夜，次日挑取单个菌落的阳性克隆,在5mL含

AmpLB中培养，37℃摇床220rpm 振荡培养过夜后提取质粒，酶切鉴定。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，率的比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NGAL对肾小管上皮细胞NRK-52E细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示，H/R组NRK-52E细胞凋亡率显著增加，与正常对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与H/R组相比，H/R+pcDNA3.1-NGAL组细胞凋亡率明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

2.2 MTT检测细胞增殖 MTT法检测细胞增殖结果表明，H/R刺激可抑制NRK-52E细胞生长，与正常对照组相比，H/R组细胞活化增殖明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.01，n=3），而与H/R组比较，H/R+pcDNA3.1-NGAL组细胞增殖率上升，差异有统计学意义（P＜0.05,n=3）。见图2。

2.3 流式细胞仪检测细胞周期 细胞周期结果发现：与对照组相比，H/R组及H/R+pcDAN3.1空载组细胞G1期比例增加，S期细胞比例降低，差异具有统计学意义（P＜0.01，n=3），说明H/R刺激下NRK-52E细胞增殖受到抑制。与H/R组比较，H/ R+pcDNA3.1-NGAL组则表现为G1期细胞比例显著降低，而S及G2期细胞比例增加（P＜0.05，n=3）。见图3。

图1 各组细胞凋亡率比较注：与正常对照组比较，**P＜0.01，*P＜0.05；与HR组比较,#P＜0.05

图2 各组细胞增殖能力变化注：与正常对照组比较，**P＜0.01，*P＜0.05；与H/R组比较,#P＜0.05

图3 各组细胞周期变化注：与正常对照组比较，**P＜0.01，*P＜0.05；与H/R组比较,#P＜0.05

3 讨论

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)作为一种小分子分泌型蛋白，在成人骨髓、子宫、前列腺、唾液腺、胃、阑尾、结肠和气管以及胎儿脾脏和肺组织中都有低水平表达[5]，而在炎症时的中性粒细胞、多种上皮癌细胞中表达显著增高[6-7]。2006年Mishra J等观察到缺血再灌注损伤后的小鼠肾脏和顺铂诱导的中毒性肾损害中，小鼠尿液中NGAL显著增高[8]，引起人们对NGAL与肾脏损伤相关性的关注，多项研究报道显示，NGAL作为抑制新的生物学标准，对AKI早期诊断及预后预测具有重大意义，有关NGAL的研究引起众多学者们兴趣。2011年Barasch研究小组在Nature Medcine[9]上报道AKI时尿中NGAL不是来自正常时也低表达NGAL的中性粒细胞、肝细胞、呼吸道和肠道等上皮细胞，而主要来自损伤肾上皮。

从本次实验可知，与对照组相比较，H/R组中的NRK-52E细胞凋亡率明显提高，G1期细胞所占的百分比也明显增加，而S期细胞所占百分比却明显减小，这表明细胞增殖出现受阻的情况。与H/R组相比，H/R+pcDAN3.1-NGAL组细胞凋亡率明显降低，G1期细胞所占的比例明显下降，G2期细胞以及S期细胞所占的比例明显增多，整体细胞量出现显著的增值现象，这表明NGAL能够有效抑制细胞凋亡，以此促进细胞的快速增殖，能够起到保护肾小管内的上皮细胞。

综上所述，NGAL作为一种新发现的AKI早期诊断标志物，一方面可通过促进S期DNA合成促进细胞增殖，减轻缺血/复氧刺激导致的细胞生长抑制，另一方面，NGAL可下调多种促细胞凋亡分子表达，如内质网应激经典分子GRP78、CHOP、Caspase12，通过抑制内质网应激信号转导途径，减少细胞凋亡。

[1] 王志刚.西罗莫司对大鼠肾脏缺血再灌注损伤早期的保护及对肾小管上皮细胞修复的影响[D].郑州大学,2014.

[2] 汤天凤,郑春霞,尹茹等.肾小管损伤标志物在局灶节段性肾小球硬化患者中的变化及意义[J].肾脏病与透析肾移植杂志,2010,19(4):317-323.

[3] Cemil K.The value of serum NGAL in determination of dialysis indication[J].J Pak Med Assoc,2014,64(7):739-742.

[4] 吴心虹.肾性贫血患者NGAL与铁代谢的关系及其与中医证型相关性研究[D].福建中医药大学,2014.

[5] Journois D.NGAL more or less than a biomarker?[J].Ann Fr Anesth Reanim,2013,32(3):134-135.

[6] Lippi G.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL):the laboratory perspective[J].Clin Chem Lab Med,2012,50(9):1483-1487.

[7] 王燕劲,沈婷婷,吴洪銮,等.提取的尿蛋白及糖基化终产物对肾小管上皮细胞自噬通路的影响[J].中华肾脏病杂志,2014,30(9):695-701

[8] 张敏,彭翔,严斌,等.肾康注射液对脓毒症大鼠急性肾损伤的保护作用[J].武汉大学学报（医学版）,2015,36(1):110-113,150.

[9] Paragas N.The Ngal reporter mouse detects the response of the kidney to injury in real time[J].Nat Med,2011,17(2):216-222.

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.34.010

江西 338000 江西省新余市人民医院 （康文龄）