AQP4及AQP4 mRNA在重型脑损伤中脑脊液中的表达及意义

谯明 彭艳 杨汉兵 雷振富 王俊英 彭雪刚 文刚

AQP4及AQP4 mRNA在重型脑损伤中脑脊液中的表达及意义

谯明 彭艳 杨汉兵 雷振富 王俊英 彭雪刚 文刚

目的 观察重型脑损伤后脑脊液中水通道蛋白4（AQP4）及AQP4 mRNA的表达变化及意义。方法 选取重型颅脑损伤患者51例，对每例患者第0、3、7天脑脊液进行AQP4 ELISA（酶联反应吸附实验）含量测定，RT-PCR（实时定量聚合酶链式反应）测定AQP4 mRNA表达。结果 第0、3、7天脑脊液中均可检测AQP4及AQP4 mRNA。第3天较第0天升高（P＜0.05），第7天较第3天降低（P＜0.05），第7天与第0天比较，差异无统计学意义。AQP4与AQP4mRNA相关（r=0.867）。结论 重型脑损伤后患者脑脊液AQP4的表达随着病程变化，推测AQP4可能参与了脑损伤的病理过程，与病情的转归相关。

重型脑损伤；水通道蛋白4

水通道蛋白（aquaporins）有一个六跨膜α-螺旋结构域和共有天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸基序，它构成了孔的一部分，在动植物及微生物细胞中广泛分部的细胞膜转运蛋白，与水通透性相关。1988年，Agre在分离红细胞Rh蛋白时首先发现一种具有选择性水通透的功能，分子量为28kD的蛋白，随后被命名为AQP1[1]，至今在哺乳动物中共发现13种水通道蛋白家族。其中在脑内发现6种水通道蛋白，其中AQP4是脑内最重要、分布最广的水通道蛋白，证明参与调控脑组织中水的沿渗透梯度由低渗向高渗移动[2]，与脑损伤后脑水肿的发生密切相关[3]。但现有研究均着重于动物实验，对人体的直接研究较少。本研究观察重型脑损伤后脑脊液中AQP4及AQP4 mRNA的表达变化及意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年7月～2014年12月四川省仁寿县人民医院重症医学科收治的重型颅脑损伤患者51例，GCS（格拉斯哥昏迷指数）评分4～8分，年龄23～73岁，平均（45±15）岁，其中男28例，女23例，其中4例患者于3d内死亡。受伤至手术时间0.5～3h。每例均行3次APECHEⅡ（急性生理与慢性健康评分）评分，均在10～25分，并行头颅CT扫描确定颅内不同区域脑损伤。

1.2 主要仪器 酶标仪：Ganthos 2010型。低速离心机：北京白杨医疗公司BY-160C型。PCR机：中山大学达安基因Da-7600型。低温冰箱：海尔公司医用低温保存箱DW-40LS08型。

1.3 主要试剂 人AQP4酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，厦门慧嘉生物科技有限公司。引物、内参及荧光PCR（聚合酶链式反应）体系由大连TaKaRa公司设计和合成。

1.4 实验方法 收集每例患者第0、3、7天脑脊液并进行

AQP4及AQP4 mRNA含量测定：

（1）术后第0、3、7天抽取脑脊液，并3000r/min离心后取上清液置予冻存管于-20℃冰箱保存。

（2）待标本收集完成后，一次性在本院检验科免疫室行

ELISA检测AQP4蛋白含量，严格按照试剂盒说明书进行实验操作，每个样本做3个复孔。

（3）RT-PCR（实时定量聚合酶链式反应）测定AQP4 mRNA的表达。

①先提取的DNA经逆转录成cDNA放-20℃冰箱保存。

②标本收集完全后行荧光定量PCR反应(SYBR Green I嵌合荧光法)测AQP4 mRNA的表达。按如下步骤进行。

1）由TaKaRa公司设计和合成人AQP4引物及内参照β-actin引物序列：

AQP4：上游5,-CGCGACTCCCAGCACATGAGAGC TGCACTCTGGCTGGGATAA-3,下游5,-GTCCTAAGC TTGTGAAAAATAAACATTTTGGATAAC-3。PCR产物：6216 bp。

β-actin：上游5,-CATCCGTATAGCGTCGTCAAGAC CTCTATGCCAAC-3,；下游5,-ATGGAGCCTAGCCTGCC GCGAACCGATCCACA-3。PCR产物：620 bp。

2）以CDNA 3L，总15L规格给予逆转录成mRNA，其中予1个循环95℃3分钟预变性；40个循环95℃10秒变性，63.1℃30秒退火；再予80个循环55℃10秒融解。由RT-PCR机自动得出Ct值。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0软件对数据进行统计分析。计量资料用“x±s”表示，两样本均数比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

每例样本反应结束后由计算机自动计算并读出定量结果Ct值(threshold cycle)。采用Ct值。2-△△Ct法(△Ct＝Ctβ-actin－CtMuc5ac)进行相对定量。从以上脑脊液AQP4和β-actin扩增曲线图和融解曲线图可以看出(各标本均有扩增，且扩增效率高。各标本融解曲线无二聚体及非特异扩增峰，肺组织各峰值基本一致，说明引物设计合理，特异性高。见图1～图4。

图1 β-actin扩增曲线图

图2 β-actin融解曲线图

图3 脑脊液AQP4扩增曲线图

图4 脑脊液AQP4融解曲线图

脑脊液中AQP4蛋白及mRNA表达从第0天开始就升高，在第3天到高峰，第7天下降至正常水平。脑脊液中AQP4蛋白及mRNA表达第3天比第0天明显增高，而第7天与第0天差异无统计学意义。第7天比第3天差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 脑脊液中AQP4蛋白表达（x±s）

3 讨论

脑水肿是引起颅内高压并脑疝的危险因素。研究表明，APQ4在颅内钾的稳态中有重要的作用，并可激活小胶质细胞，参与血脑屏障（BBB）的破坏和释放血管性水肿的趋化因子和细胞因子，由此AQP4的作用是水肿的形成和BBB破坏[4]。在脑出血大鼠模型中AQP4及AQP4 mRNA高表达[5]。在动物实验中，缺少AQP4的小鼠脑组织可增加25%的体积[6]。

目前临床上常用甘露醇及呋塞米进行脱水利尿降颅内压，研究表明小鼠脑损伤模型中，注射甘露醇组的脑水肿程度及AQP4 表达都不同程度地降低[7]，但在本临床观察中，所有的脑出血组患者均给予甘露醇或/和呋塞米，但是AQP4的蛋白含量均不受此影响，持续增高，直到第7天。由此说明常规的脱水剂的应用并不能减轻脑组织水肿，仅能通过减少细胞外的水分来缓解颅内压的增高，减轻颅内压的效果并不理想，并均可引起明显的水电解质紊乱，而引起相应的并发症，增加患者的治疗时间及后遗症发生。

由此，AQP4蛋白的表达上调与脑水肿的发生、发展密切相关。目前已经在动物实验中证实脑水肿给予抑制或拮抗AQP4蛋白的产生、表达可缓解脑水肿的表达[8-10]。另外，AQP4蛋白表达的高低与脑水肿的轻重程度密切联系[11]。

本研究结果表明脑水肿从创伤性脑损伤发生开始，第3天到高峰，持续到第7天，若有专门拮抗AQP4通道药物给予关闭水通道，减少自由水进入脑组织细胞内，可有效缓解脑水肿，有利于神经组织恢复和避免进一步损伤加重。未来可通过监测AQP4或AQP4 mRNA的水平来临床评估脑水肿的病情及预后。

但本研究样本量较少，具体的AQP4调控机制不明，对AQP-4的表达和调控的相关信号转导通路的深入研究,可以在将来更好地调控AQP4的水平来控制脑水肿的发生、发展，并对药物研制、临床诊断提供新的思维更进一步的研究明确。

[1] Agre P,Bonhivers M,Borgnia MJ.The aquaporins,blueprints for cellular plumbing systems[J].J Biol Chem,1998,273(24):14659-14562.

[2] Tang Y,Wu P,Su J,et al.Effects of Aquaporin-4 on edema formation following intracerebral hemorrhage[J].Exp Neurol,2010,223(2):485-495.

[3] Graber DJ,Levy M,Kerr D,et al.Neuromyelitis optica pathogenesis and aquaporin 4[J].J Neuroinflammationm,2008,29(5):22.

[4] Fukuda AM,Badaut J.Aquaporin 4:a player in cerebral edema and neuroinflammation[J].J Neuroinflammation,2012,9:279.

[5] Ren Z,Iliff JJ,Yang L,et al.'Hit & Run' model of closed-skull traumatic brain injury(TBI)reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation[J].J Cereb Blood Flow Metab,2013,33(6):834-845. [6] Yao X,Hrabetová S,Nicholson C,et al.Aquaporin-4-deficient mice have increased extracellular space without tortuosity change[J].J Neurosci,2008,28(21):5460-5464.

[7] 翁晓建,李守缄,唐霍全.甘露醇对重型颅脑损伤后脑组织含水量及AQP4 表达的变化[J].中国现代医生，2009,47：32-33.

[8] Ding Z,Zhang J,Xu J,et al.Propofol administration modulates AQP-4 expression and brain edema after traumatic brain injury[J].Cell Biochem Biophy，2013，67(2):615-622.

[9] Chen GS,Huang KF,Huang CC,et al.Thaliporphine derivative improves acute lung injury after traumatic brain injury[J].Biomed Res Int,2015,2015:729831.

[10] Tang G,Liu Y,Zhang Z,et al.Mesenchymal stem cells maintain bloodbrain barrier integrity by inhibiting aquaporin-4 upregulation after cerebral ischemia[J].Stem Cells,2014,32(12):3150-3162.

[11] Neal CJ,Lee EY,Gyorgy A,et al.Effect of penetrating brain injury on aquaporin-4 expression using a rat model[J].J Neurotrau ma,2007,24(10):1609-1617.

Objective To observe the change of aquaporin (AQP)4 and AQP4 mRNA level in the cerebrospinal fluid of patients with severe brain injury and its clinical significance. Methods There are 51 severe traumatic brain injury patients. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) was used to determine cerebrospinal fluid AQP4 protein expression after 0,3,7 days，and RT-PCR (reverse transcription PCR) was used to determine AQP4 mRNA expression. Results AQP4 protein or mRNA expressed within the 0,3,7 days.The level of AQP4 or AQP4 mRNA increased 3 days after operation (P ＜0.05),and then statistically decreased 7 days after operation (P ＜0.05). But the 7 days had no statistically difference compared with 0 day after operation. Conclusion After Brain injury, AQP4 expression changes after brain injury is closely related with the formation of cerebral edema, AQP4 in the damage brain edema formation plays an important role.

Aevere brain injury; Aquaporin4

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.34.008

四川 620500 眉山市第二人民医院（仁寿县人民医院）重症医学科 （谯明 彭艳 王俊英 彭雪刚 文刚） 眉山市第二人民医院（仁寿县人民医院）神经外科 （杨汉兵） 眉山市第二人民医院（仁寿县人民医院）检验科 （雷振富）

谯明 E-mail：qiaosong1980@163.com