HPLC法同时测定少腹逐瘀丸中芍药苷、阿魏酸、桂皮醛和异鼠李素-3-0-新橙皮苷含量

史宪海，杨 艳，杜 娟

(山西省食品药品检验所，山西太原 030001)

少腹逐瘀汤剂处方始收载于清朝老中医王清任的《医林改错》下卷，可治疗多种妇科疾病且疗效显著，素有“妇科第一方”之称［1，2］，由当归、蒲黄、五灵脂(醋炒)、赤芍、延胡索(醋制)、没药(炒)、川芎、肉桂、炮姜、小茴香(盐炒)等十味中药材，加入一定比例炼蜜制成大蜜丸，用于寒凝血瘀所致的月经后期痛经，产后腹痛，症见行经后错、行经小腹冷痛、经血紫暗、有血块、产后小腹疼痛喜热、拒按。现收载于《中国药典》2010年版一部［3］，标准中无含量测定项目。目前文献报道［4-6］的关于处方药味控制均为单一成分的含量测定方法，而多指标多成分共同控制中成药质量已经是现代中药质量控制的发展趋势。本实验选择4个化学成分作为检测指标，采用HPLC法同时测定其含量，分别控制处方中4种主要药味的质量，实验方法简便、灵敏、准确，分离效果好，可作为少腹逐瘀丸质量标准提高的参考依据。

1 仪器与试药

仪器:WATERS 2695-2998高效液相色谱仪，二极管阵列检测器;对照品:芍药苷、阿魏酸、异鼠李素-3-0-新橙皮苷、桂皮醛(批号分别为:110736-201136、110773-201012、111571-200537、110710-201016)，均购于中国食品药品检定研究院;试药:乙腈为色谱纯;水为纯化水;甲醇、磷酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:自装柱富士填料 C18(5 μm，4.6 mm×250 mm);流动相采用梯度洗脱(A为乙腈，B为0.1%磷酸溶液)，A∶B为0 min10∶90，50 min35∶65，流速:1.0 mL·min－1;柱温:室温;检测波长280 nm，进样量10 μL。

2.2 供试品提取方法的考察

2.2.1 提取溶剂的考察分别采用甲醇、70%甲醇超声提取法，通过比较，为了能使大蜜丸充分溶散，采用70%甲醇超声提取法效果最佳。

2.2.2 提取时间的考察采用超声提取法，分别超声30、40、50、60 min，结果超声处理30 min与60 min结果基本一致，故将超声时间定为30 min。

2.3 专属性实验

分别取处方中除赤芍、当归、川芎、蒲黄及肉桂外的全部药味，按本品工艺及供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液，注入液相色谱仪进行测定，结果表明:芍药苷、阿魏酸、异鼠李素-3-0-新橙皮苷、桂皮醛保留时间处无干扰(见图1)。

图1 专属性试验对照、样品和阴性样品色谱图Fig.1 Chromatogram of the Test Control，Sample and Negative Sample Chromatogram of the Special Properties

2.4 耐用性实验

采用不同仪器:a)日本岛津LC-20AHT型高效液相色谱仪;b)WATERS 2695-2998高效液相色谱仪;自装柱，富士填料，C18(5 μm，4.6 mm × 250 mm)，均能达到良好的分离效果。

2.5 线性关系的考察

分别取对照品溶液，按照“2.1色谱条件”项下实验，以峰面积值和进样量进行线性回归(mg·mL－1)，结果表明，芍药苷在0.808 ～6.066 μg范围内线性关系良好(回归方程为 Y=80 424X －7 156，r2=0.999);阿魏酸在0.062 5 ～0.625 2 μg范围内线性关系良好(回归方程为 Y=30 676X+723，r2=0.999);异鼠李素-3-0-新橙皮苷在0.11 ～1.68 μg范围内线性关系良好(回归方程为Y=64 401X+2 833，r2=0.999);桂皮醛在0.05 ～0.96 μg范围内线性关系良好(回归方程为Y=8 ×106X+9 349，r2=0.999)。

2.6 样品的测定

按拟定含量测定方法制备样品，按照“2.1色谱条件”项下实验，依法对收集到的26批次样品进行含量测定，测得结果见表1。

表1 26批次含量测定结果Table 1 Results of 26 Batch Content Determination

2.7 精密度考察

取同一供试品(批号7280003)溶液，同一进样量，连续进样6次，按照“2.1色谱条件”项下实验，结果测定峰面积值的 RSD分别为芍药苷1.5%、阿魏酸2.0%、异鼠李素-3-0-新橙皮苷1.7%、桂皮醛1.9%，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性考察

取同一供试品(批号7280003)溶液，24 h内每隔4 h按同一进样量进样，按照“2.1色谱条件”项下实验，结果不同时间测定峰面积值的RSD分别为芍药苷1.6%、阿魏酸2.2%、异鼠李素-3-0-新橙皮苷1.4%、桂皮醛1.9%，表明24 h内样品溶液稳定。

2.9 重复性考察

对同一批号(批号7280003)的6份样品按拟订的含量测定方法进行平行实验，按照“2.1色谱条件”项下实验，结果不同时间测定峰面积值的RSD分别为芍药苷1.4%、阿魏酸0.7%、异鼠李素-3-0-新橙皮苷2.0%、桂皮醛0.9%，表明本方法重复性良好。

2.10 准确度实验

采用加样回收法，取上述重复性实验所用的样品(7280003批)，取1 g(9份)，精密称定，分别精密加入芍药苷、阿魏酸、异鼠李素-3-0-新橙皮苷、桂皮醛对照品一定量，按拟定含量测定方法制备样品，按照“2.1色谱条件”项下实验，计算平均回收率和RSD分别为97.9%、2.5%，99.5%、2.5%，99.5%、1.3%，99.2%、1.9%，结果表明回收率符合含量测定要求。

3 讨论

3.1 检测波长确定

实验中选择PDA检测器，波长范围190～400 nm进行检测，结果发现采集280 nm附近波长的色谱图，各成分均有良好的响应，基线平稳，色谱峰分离良好，故选择280 nm作为检测波长。4种成分的最大吸收波长分别为:芍药苷238 nm、阿魏酸315 nm、桂皮醛285 nm、异鼠李素-3-0-新橙皮苷254 nm。

3.2 样品检测结果分析

6家企业26批次样品检测结果，芍药苷含量介于9.7 ～82.5 mg/丸，阿魏酸含量介于0.09 ～0.26 mg/丸，桂皮醛含量介于0.08 ～5.37 mg/丸，异鼠李素-3-0-新橙皮苷含量介于0～5.36 mg/丸，各成分含量差异很大，甚至有1批次未检测到异鼠李素-3-0-新橙皮苷，现行标准中有控制项目的赤芍含量全部较高合格，未控制的当归、川芎、肉桂及蒲黄含量普遍偏低，尤其是当归和川芎，提示本品现行标准的质量控制水平亟待提高。

3.3 实现质量控制水平的提升

目前文献报道的关于处方药味控制均为单一成分的含量测定方法，而多指标多成分共同控制中成药质量已经是现代中药质量控制的发展趋势。少腹逐瘀丸现行标准仅有赤芍、当归、川芎、肉桂、蒲黄的显微鉴别，而无含量测定控制项目，本实验选择芍药苷、阿魏酸、桂皮醛和异鼠李素-3-0-新橙皮苷4个化学成分作为检测指标，实现了同一条件控制多味药材的质量。经方法学验证，本方法简便、灵敏、准确、可靠，分离效果好，可作为少腹逐瘀丸质量标准提高的参考依据，对处方含有类似药味制剂的质量控制也有一定的借鉴作用。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典临床用药须知——中药成方制剂卷［S］.2010年版，北京:中国医药科技出版社，2011.

［2］肖培根，主编.新编中药志［S］.北京:化学工业出版社，2006.

［3］国家药典委员会.中国药典［S］.2010年版一部，北京:中国医药科技出版社，2010.

［4］李 曦，张丽宏.不同产地“当归类”药材中藁本内酯含量比较［J］.中国中药杂志，2013，17(2):133-136.

［5］王 婕，赵建邦，宋平顺.30批当归中阿魏酸、藁本内酯含量测定［J］.中国实验方剂学杂志，2011，16(2):133-136.

［6］刘 斌，陆蕴如.高效液相色谱法测定蒲黄中2种黄酮苷的含量［J］.药物分析杂志，1998，18(2):80-83.