固定化双孢菇漆酶对萘酚绿B脱色的研究

夏文静　李飞　周惠等

摘要 [目的]研究固定化双孢菇漆酶对萘酚绿B的脱色效果。[方法]利用固定化的双孢菇漆酶对萘酚绿B进行脱色，研究了温度、萘酚绿B浓度、固定化漆酶用量、酸根离子以及金属离子对脱色效果的影响。[结果]当脱色温度为40 ℃，脱色时间为4 h，萘酚绿B浓度为60 mg/L时，脱色率可以达到96.6%。酸根离子中PO3-4、CO2-3、Cl-对脱色率有抑制效果，金属离子中Cu2+、Mg2+对脱色率有促进效果，脱色率可以达到99.3%和97.6%。Fe2+对脱色率有抑制，脱色率是不添加金属离子的27%。[结论]该研究可为萘酚绿B的脱色提供了一条新途径。

关键词 固定化漆酶；萘酚绿B；金属离子；酸根离子；脱色率

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）15-220-02

The Decoloration of Naphthol Green B by Immobilized Laccase from Agaricus bisporus

XIA Wenjing， LI Fei， ZHOU Hui et al

（School of Biotechnology and Chemical Engineering， Taizhou College， Nanjing Normal University， Taizhou， Jiangsu 225300）

Abstract [Objective] The research aimed to study the decoloration effect of naphthol green B by immobilized laccase from Agaricus bisporus. [Method] Using the immobilized laccase from Agaricus bisporus to decolor naphthol green B， the effects of temperature， naphthol green B concentration， immobilized laccase usage， acidic group ion and metal ion on the decoloration were studied. [Result] When decoloration temperature was 40 ℃， and decoloration time was 4 h， and naphthol green B concentration was 60 mg/L， decoloration rate could reach 96.6%. In acidic group ions， PO3-4， CO2-3 and Cl- had inhibition effects on decoloration rate. In metal ions， Cu2+ and Mg2+ had promoting effect on decoloration， with decoloration rates of 99.3% and 97.6%， while Fe2+ had inhibition effect， which was 27% of decoloration rate not adding metal ions. [Conclusion] The research could provide a new channel for decoloration of naphthol green B.

Key words Immobilized laccase； Naphthol green B； Metal ion； Acidic group ion； Decoloration rate

目前，我国工业废水对环境的污染十分严重，尤其是染料废水的污染。每年产生的染料已经超过了7 000万t[1-2] 。国内使用的大多染料稳定性好、耐光、耐微生物腐蚀，因此排放到环境中的染料废水难被降解。漆酶能够催化许多芳香族化合物并有广泛的作用底物，具有很大的实际应用价值[3]。目前人们对漆酶的研究越来越多，漆酶成为环境保护用酶研究的热点。笔者利用筛选的双孢菇所产的漆酶对萘酚绿B进行脱色研究，为萘酚绿B的脱色提供了一条新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

漆酶：南京师范大学泰州学院微生物实验室所产的杏鲍菇漆酶。

试剂：萘酚绿B、磷酸钠、碳酸钠、氯化钠、硫酸钠、硫酸铜、硫酸亚铁、硫酸铝、硫酸镁、硫酸钾、硫酸钠（国药）。

1.2 试验方法

1.2.1 100 mg/L的萘酚绿B的配制。称取0.01 g的萘酚绿B，用95%的乙醇溶解至10 ml，萘酚绿B的浓度为1 g/L，再用缓冲液柠檬酸钠稀释成100 mg/L的浓度。

1.2.2 不同浓度的萘酚绿B溶液的配制。不同浓度的萘酚绿B的配制见表1。

2 结果与分析

2.1 温度对染料脱色效果的影响

取10 ml 100 mg/L的萘酚绿B，加入1 g固定化的小球，分别放置在25、30、35、45 ℃的条件下进行脱色，在0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0 h分別取样，结果如图1所示。由图1可知，随着温度的升高。萘酚绿B的脱色率逐渐升高。当脱色温度为40 ℃时，随着时间的延长脱色率逐渐增大，当脱色时间为4 h时，脱色率达到872%，随后随着时间的延长，脱色率基本保持不变。综合4个温度对脱色的影响，确定最佳的脱色温度为40 ℃，脱色时间为4 h。

2.2 萘酚绿B浓度对脱色效果的影响

取10 ml 不同浓度的萘酚绿B（20、40、60、80、100 mg/L），分别放入1 g固定化的小球，放在40 ℃的条件下保温4 h，结果如图2所示。由图2可知，萘酚绿B浓度在20～60 mg/L的范圍内脱色率变化不大，维持在96%左右，此后随着萘酚绿B浓度的增加，脱色率有所下降，当浓度为80 mg/L时，脱色率为90.2%，当浓度为100 mg/L时，脱色率为87.9%。

2.3 酶用量对萘酚绿B染料的脱色影响

称取0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 g的小球分别放入到60 mg/L的10 ml染料中，在40 ℃的条件下保温4 h，结果如图3所示。由图3可知，随着小球用量的增加，脱色率不断增大，当小球质量为100 g时，脱色率为96.5%，是小球用量为0.25 g时脱色率的1.61倍。此后随着小球用量的增加，脱色率基本保持不变。

2.4 酸根离子对染料脱色的影响

在60 mg/L的萘酚绿B溶液中加入不同的酸根离子（PO3-4、CO2-3、Cl-、SO2-4）的钠盐，使酸根离子的终浓度为50 mmol/L，比较酸根离子对脱色率的影响。结果表明，SO2-4对萘酚绿B的脱色效果影响不大，其他酸根离子均有抑制作用。其原因是PO3-4、CO2-3、

Cl-破坏了酶与底物形成的复合物的离子键、氢键等的相互

作用力，从而也改变了漆酶的活性。

2.5 金属离子对染料脱色的影响

酶是一种蛋白质，其催化效果受诸多因素的影响，其中，不同金属离子对酶活力的影响不同[4]。漆酶是一种铜蛋白，每个漆酶蛋白分子含有4个铜离子，这4个铜离子在漆酶的氧化反应中起决定作用。金属离子可能是酶的组成部分，也有可能是酶的激活剂或抑制剂。

该试验在萘酚绿B的脱色反应体系中加入6种金属离子（Cu2+、Fe2+、Al3+、Mg2+、K+、Na+）的硫酸盐，并使金属离子的终浓度为1 mmol/L，在40 ℃的条件下保温4 h。结果表明，Cu2+ 、Mg2+对脱色率有促进作用，这是因为Cu2+ 、Mg2+是酶的激活剂[5]，Cu2+ 、Mg2+使酶的活力提升，从而提高脱色率。Fe2+对脱色率有抑制作用，这可能是因为Fe2+占据了底物与酶的结合位点，从而使酶活性受到了抑制作用[6]。

3 结论

笔者采用固定化的漆酶小球对萘酚绿B进行脱色，探讨了温度、浓度、固定化漆酶用量、酸根离子和金属离子对萘酚绿B脱色的影响，在40 ℃的条件下，对60 mg/L的萘酚绿B脱色4 h，脱色率可以达到96.6%。笔者还对酸根离子和金属离子进行研究，发现PO3-4、CO2-3、Cl-对脱色率都有不同程度的抑制作用，因此在进行萘酚绿B的脱色时，要注意选择合适的溶液。此外还发现Cu2+和Mg2+对脱色有一定的促进作用，因为这两种离子是酶的激活剂，Fe2+对脱色具有明显的抑制效果，这是由于Fe2+竞争性地结合了酶的活性位点。

参考文献

[1] AYED L，MAHDHI A，CHEREF A，et al.Decolorization and degradation of azo dye methyl red by an isolated Sphingomonas paucimobilis：Biotoxicity and metabolites characterization[J].Desalination，2011，274（1/3）：272-277.

[2] KADAM A A，TELKE A A，JAGTAP S S，et al.Decolorization of adsorbed textile dyes by developed consortium of Pseudomonas sp SUK1 and Aspergillus ochraceus NCIM1146 under solid state fermentation[J].Journal of Hazardous Materials，2011，189（1/2）：486-494.

[3] 郑苗苗，焦战战，张令昂，等.红平菇产漆酶条件优化及对孔雀绿染料脱色的研究[J].微生物学杂志，2014，34（4）：58-41.

[4] 李金花，程远征，张洪林.纤维素降解过程中金属离子作用的研究[J].临沂师范学院学报，2005，27（3）：30-32.

[5] 周德庆.微生物学教程[M].北京：高等教育出版社，2002.

[6] 朱显峰，丁涛.常见金属离子对漆酶酶活的影响[J].化学研究，2003，14（3）：50-54.