杂色鲍原代细胞培养方法的优化及其在基因功能研究中的应用

李敏　张丽莉　王国栋等

摘要 优化了杂色鲍原代细胞的培养条件，并利用原代细胞进行了RNAi和外源基因表达。结果表明，较高的渗透压对血淋巴细胞培养起重要作用，淋巴细胞分离液分离血淋巴细胞更利于其生长。原代细胞培养至第5天，在细胞培养液中添加50 μg MyD88 dsRNA，能够显著降低MyD88 mRNA的表达。pEGFPN1转染培养5 d的鳃细胞，5 d后可以检测到绿色荧光。该研究表明可以成功培养杂色鲍血和鳃原代细胞，并且利用原代细胞可以进行功能基因表达量调低或调研究，为功能基因注释提供了便利条件。

关键词 杂色鲍；原代细胞培养；RNAi；转染

中图分类号 S917 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）15-146-05

Optimizing Primary Cell Culture Method of Haliotis diversicolor and Its Effect for Gene Function Study

LI Min1，2， ZHANG Lili1，2， WANG Guodong1，2* et al

（1. Fisheries College， Jimei University， Key Laboratory of Healthy Mariculture for the East China Sea， Ministry of Agriculture， Xiamen， Fujian 361021； 2. Institute of Aquaculture Biotechnology， Jimei University， Xianmen， Fujian 361021）

Abstract The condition of primary cell culture was optimized in Haliotis diversicolor and these primary cells of hemocyte and gill were used in RNA interference （RNAi） and exogenous gene expression. Results suggested that hemocyte survived better in higher osmolarity of media， the way of using lymphocyte separation medium to culture hemocyte was beneficial for cell growth. MyD88 dsRNA were added to cell culture medium of hemocyte and gill after 5 days of culture which reduced the expression of MyD88. The plasmid pEGFPN1 was transfected into gill after 5 days of culture and the green fluorescence was detected 5 days later. Above all， the primary cell can survived in vitro and they are a proper tool for gene function analysis by regulating gene expression up or down， which provide convenient way for functional annotation.

Key words Haliotis diversicolor； Primary cell culture； RNAi； Transfection

雜色鲍是我国南方地区重要的水产养殖经济物种之一。但是，随着其养殖规模的扩大，爆发性病害日益严重，已成为杂色鲍养殖业重要的限制因素。杂色鲍疾病流行的原因众多[1-3]，但其解决方案却都需要杂色鲍免疫分子机制基础资料的支撑。动物机体是一个完善自稳系统，由多种器官和组织构成，各有专职，但又相互配合影响。以整个动物机体为试验材料进行免疫机制研究时，难以克服各个系统和组织之间的调控和反馈。由于影响因素众多、试验背景复杂，导致试验数据分析困难，难以确切描述处理因素和生物机体响应之间的关系。细胞系因其细胞类型单一、功能一致，可以看作是单个细胞的放大，能够避免上述问题，因此被认为更适合进行免疫功能基因的研究分析[4]。

体外细胞培养已成为研究复杂生命过程的重要手段之一，并在免疫学、病毒学和细胞工程等领域被广泛运用。海洋无脊椎动物，特别是软体动物的细胞培养至今都未取得良好的成果。由于缺少无脊椎动物细胞的生理生化知识，构建贝类细胞培养存在一系列难题[5-6]，比如共生微生物污染、不恰当的处理造成成体活力减弱、体外细胞增殖缓慢、培养基成分不确定、没有合适的培养基质和蛋白水解酶损害细胞等。因此，目前唯一的软体动物细胞系来源于胚胎的淡水蜗牛（Bromphalaria glabrat）的BGE[7]。此外，晏萌利用栉孔扇贝（Chlamys farreri）的发育潜能较高的幼虫进行原代培养，已经传代到18代，并进行了细胞冻存[8]。由于构建细胞系存在多种困难，研究人员转而投向软体动物原代细胞培养。软体动物的原代细胞作为重要的研究手段，在神经生物学、免疫学、毒理学、环境科学和功能基因组学等学科都作出了贡献。

Bulloch认为神经元原代细胞培养可以准确反映神经元的消融和互补[9]，控制节奏的行为神经网络识别和映射[10]。Le Pennec对欧洲大扇贝（Pecten maximus）培养的96 h的消化腺腺泡原代细胞进行FDA荧光法、MTT比色法和中性红染色试验，证明其在结构和功能上保持活性[11]。Parolini采用斑马纹贻贝（Dreissena polymorpha）的血淋巴、鳃和消化腺原代细胞检测阿替洛尔、卡马西平、双氯芬酸和菲诺贝特这4种化合物的毒性，台盼蓝排斥试验表明鳃细胞和血细胞对这些药物具有较高的灵敏度，可以用来进行生态毒理学研究[12]；AuzouxBordenave研究表明人的降钙相关蛋白CGRP可以调节疣鲍（Haliotis tuberculata）原代外套膜和血淋巴细胞的活性，并且增加碳酸酐酶活性，这与活体结果研究一致，表明CGRPlike控制靶细胞生物矿化过程[13]。

笔者对杂色鲍的血淋巴、鳃和粘液腺进行原代细胞培养，并优化了细胞培养渗透压和细胞分离方法，在获得状态良好原代细胞的基础上进行了RNAi和外源基因表达质粒转染试验，旨在为研究贝类基因的功能提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物。

杂色鲍购自厦门培阳水产养殖有限公司，体重为（9.8±0.5）g，暂养于曝气海水中，水温约25 ℃，每天投喂新鲜海带。

1.1.2 培养基。

以商品化DMEM/F12（Hyclone）为基础培养基，添加不同浓度的胎牛血清（Hyclone）和饱和NaCl溶液（调节pH至7.2，121 ℃ 高压灭菌20 min），并且添加1 %的双抗（Hyclone）和0.25 μg/ml两性霉素以及生长因子（0.5 ‰ β巯基乙醇、50 μg/ml N乙酰葡糖糖胺、50 μg/ml 羧甲基纤维素钠、10 μg/L Human FGFbasic、5 μg/L Human EGF、1 μg/L Human HGF）。将制备的培养基于4 ℃下保存，使用时间不超过1个月。

1.2 方法

1.2.1 杂色鲍的前期处理。

选取活力好的杂色鲍，于过滤灭菌海水中培养2 h后，移入无菌操作台中，置于一次性培养皿上，用移液枪吸取含双抗的过滤灭菌海水反复冲洗杂色鲍腹足，并用灭菌纱布块擦拭。

1.2.2 血细胞处理。

用一次性灭菌手术刀片割腹足中部，并滴加抗凝剂（0.15 g EDTA和0.1 g肝素钠溶于10 ml稀释10倍后的饱和NaCl溶液，过滤除菌）于伤口处，将500 μl血加入200 μl的抗凝剂中，混匀，4 ℃，2 000 g，离心5 min。小心弃去上清，轻轻吹打血细胞，移入培养瓶中，补加培养液至5 ml。或者根据索莱宝人淋巴细胞分离液试验步骤，将500 μl血细胞加入200 μl的抗凝剂中轻轻颠倒混匀后，全部加到3 ml淋巴分离液中，2 000 g离心20 min。移去上层血清，加入培养液重悬细胞，转移到培养瓶中。培养24 h后，观察细胞形态。

1.2.3 鳃和粘液腺的处理。

用镊子取出鳃和粘液腺，将整片鳃和粘液腺浸泡在灭菌含双抗和两性霉素的过滤海水中，每次5 min，重复5次（若有组织粘液，浸泡后将组织块置于灭菌纱布块上，吸去组织粘液）。用手术刀片将消毒后的鳃切成较小的组织块，移入15 ml离心管中，加入2 ml胰酶消化5 min，吸除胰酶，加入3 ml培养液终止消化，吹打组织块尽量使组织块分散。将消化后的组织块移入25 cm2的细胞培养皿中，组织块均匀分布在培养瓶表面后，吸掉剩下的培养液，干贴倒置24 h后加入5 ml高盐培养液正置培养。

1.2.4 转染pEGFPN1质粒。

吸取過夜培养的菌液100 ml，按照全式金公司去内毒素质粒大提试剂盒步骤提取质粒。取稳定培养的血细胞和鳃，按照去除旧培养液，稀释10倍的饱和氯化钠溶液清洗1～2次，添加不含血清和双抗的培养液。将10 μg 质粒稀释于500 μl opti MEM（Gibco）中，轻轻混匀；然后将20 μl Sofast转染试剂（梭华Sofast）稀释于500 μl opti MEM中，轻轻混匀；将转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中，边滴加边混匀。孵育20 min后，每孔添加100 μl的Sofast质粒复合物，轻轻摇动使其与培养液混合均匀。26 ℃，5% CO2培养48 h后，检测荧光表达。

1.2.5 dsRNA合成。

将获得的杂色鲍MyD88序列输入到siDirect version 2.0（http：//sidirect2.rnai.jp/）中查找RNA 干扰靶位点，选取1段大小为573 bp（357～929 bp，登录号为KF922374）的片段作为干扰序列，选取pEGFPN1中绿色荧光蛋白的1段大小为655 bp（741～1 395 bp）的片段作为阴性对照。将这2个序列分别克隆到pGEMT载体中，测序验证序列的正确性。制备含T7的线性化DNA正向和反向片段，使用Promega胶回收试剂盒回收，根据T7 RiboMAXTM Express 步骤制备dsRNA，将合成的ssRNA均匀混合，70 ℃水浴10 min后缓慢冷却至室温形成dsRNA；加入DNase I 和Rnase A 37 ℃处理30 min后，分别取出DNA模板和单链RNA；加入0.1倍3 mol/L乙酸钠和1倍异丙醇沉淀dsRNA，70%乙醇清洗2次后，稍微干燥加入适量水溶解dsRNA，电泳检测其正确性，使用分光光度计检测其OD值。

1.2.6 dsRNA 干扰方法。

血细胞和鳃细胞培养5 d后可进行干扰试验。原代细胞中加入50 μg的MyD88 dsRNA作为试验组，以50 μg EGFP dsRNA作为阴性对照，以50 μl PBS作为空白。每组实验3个平行。处理24 h后，收集血细胞和鳃提取细胞的RNA。

2 结果与分析

2.1 原代细胞形态观察及培养条件优化

原代血细胞在培养1 h内就可以贴壁（图1A），此后3 d细胞增殖迅速（图1B），此后进入停滞阶段，大约7 d后细胞开始减少贴壁并脱落（图1C）；原代鳃细胞加入培养液培养36 h后就有细胞从组织块中迁移出来（图1D），细胞多呈颗粒状，较少有伪足，细胞大小比较均一，视野下不折射白光。并在此后数天可以持续增殖（图1F），并且可以维持10 d；原代粘液腺细胞加入培养液后只有少数细胞迁移出来并贴壁，分为2种细胞，大型细胞和小型细胞形态差异大，大型细胞近似椭圆状，小型细胞近似圆形。整体细胞数量较少，增殖不明显（图1G）。

在DMEM/F12 培养基的基础上，研究添加不同浓度（10%、15% 和20%的胎牛血清）对原代细胞增值的影响。血、鳃和粘液腺等组织在不同浓度的血清中增殖无差异，所以试验选择浓度15%的胎牛血清。

比较320、750和1 100 mOsm/kg不同渗透压对原代细胞增殖的影响，结果发现血、鳃和粘液腺等不同的组织可以在这3种渗透压中生存。在320 mOsm/kg培养条件下，细胞能够贴壁，但细胞状态较差，血细胞形态大多为近似圆形，视野下折射出较强的白光下，细胞较小，多为近似圆形、空泡，视野下折射白光（图2A），3 d后不再贴壁。在较高的渗透压条件下，呈现出较为良好的状态，细胞在1 h大多数细胞贴壁，形态饱满，大小较为均一，细胞成不规则形状，呈上皮样，伸出多个伪足，形态不一，有三角型、Y型、梭型、圆形等。但是，在1 100 mOsm/kg的渗透压下细胞贴壁情况更好（图2B和C）。

研究不同接种方法对血细胞形态的影响，结果表明直接离心的方法对细胞损伤大，细胞貼壁能力下降，凝集现象比较严重，细胞大多呈现圆形，较少伪足伸出，培养基中细胞碎片多；采用淋巴分离液的方法对血细胞存活更有利。

2.2 MyD88 dsRNA对血细胞和鳃中MyD88表达的影响

将重组载体送交上海捷瑞生物工程有限公司验证序列正确后，合成dsRNA。qPCR结果表明对培养5 d的血细胞以及培养5 d的鳃和粘液腺进行dsRNA干扰48 h后，半定量结果表明实验组MyD88 的表达量显著下降（图3A），而EGFP组和未处理组没有显著差异；经检测，血和鳃各组内参基因βactin基本没有变化（图3B）。

2.3 转染pEGFPN1质粒

梭华-Sofast介导质粒转染杂色鲍血淋巴和鳃原代细胞48 h后，置于荧光显微镜下检测绿色荧光，起初4 d未检测到荧光信号，直至第5天观察到鳃细胞具有荧光（图4），在不更换培养液的情况下荧光可以持续至第10天。血细胞状态由上皮样逐渐萎缩变圆至脱落，因此不能观察到荧光，鳃细胞形态基本上没有发生变化。

3 讨论

3.1 培养基渗透压的确定

培养基中的无机盐有助于保持细胞的渗透平衡，陆地和淡水动物的渗透压往往较低，商品化培养基的渗透压也都是参照哺乳动物而设置的（人的生理盐度是0.9%，渗透压约为260～350 mOsm/kg），而大部分海洋动物的渗透压较高[14-15]，所以需要调整海洋动物培养基的渗透压。日本文昌鱼（Branchiostoma belcheri）细胞培养发现表皮、鳃、内脏、卵巢可以在渗透压为450～850 mOsm/kg中存活，但在750 mOsm/kg渗透压条件下细胞形态最佳；培养日本对虾（Penaeus japonicus）肝胰腺细胞的渗透压为730 mOsm/kg时，细胞生长较好[16]；欧洲鲍螺（Haliotis tuberculata）的鳃细胞以及紫贻贝（Mytilus edulis）的消化腺和鳃报道的培养基渗透压为1 100 mosm/kg [17-18]。该试验中检测不同渗透压对血细胞形态的影响，发现较高渗透压有利于细胞生长，细胞在形态和存活时间上都优于低渗透压，这与其他海洋动物培养相似[6]，需要调节培养基的渗透压至较高的浓度（大约是哺乳动物的2～3倍）才能维持正常的生理活动。

3.2 原代细胞的处理

仿刺参（Apostichopus japonicus）体腔细胞液细胞经离心重悬后再培养，发现细胞碎片增多，贴壁能力下降，推测其可能原因是离心后相互挤压得非常结实，经吹打后贴壁能力下降[19]。利用淋巴细胞分离液成功对鲤鱼、虹鳟鱼对血液的淋巴细胞进行分离[20-21]；笔者所在实验室也利用分离液对眼斑拟石首鱼（Sciaenops ocellatus）的血液进行分离，并成功建立了细胞系，并进行核型分析（未报道）。笔者比较2种处理血淋巴细胞的不同方式对其生长的影响，结果表明直接离心的方法对细胞损伤大，可能是因为细胞在直接离心过程中细胞凝聚现象比较严重，重悬过程中造成细胞损伤，从而影响细胞贴壁及形态[19]。这是首次利用淋巴细胞分离液对软体动物淋巴细胞进行培养，结果表明使用分离法对血细胞存活和形态更为有利。

对于鳃和粘液腺，都可以在渗透压为1 100 mOsm/kg的培养基条件下生长。利用胰酶消化这2个组织，倒置干贴启动原代培养。与其他组织培养不同，软体动物的鳃和粘液腺都附着丰富的黏液，附生着大量的微生物[12，22]，所以在培养这类组织时就要采取严格的消毒措施，以防止细胞污染。在鳃和粘液腺进行除菌过程中，鳃需要在含高浓度抗生素的生理盐水中漂洗多次。对于粘液腺上，还需要用纱布块吸走粘液，这可能会对组织脱水，造成一定的损伤。倒置48 h后加入细胞培养液，粘液腺的组织块在轻微晃动的情况下就会脱离细胞培养瓶瓶底，可能是因为粘液不能被完全除尽，造成组织游离在细胞培养瓶表面，只有很少细胞会贴在瓶底；鳃的组织块贴壁比较稳固，且培养2 d后就能够在组织块附近发现有较多细胞迁移出来，且单个细胞贴壁稳固，并有增殖的现象。

3.3 MyD88 dsRNA对血细胞和鳃中MyD88表达的影响

目前，RNAi技术已经被广泛运用到海洋无脊椎动物中，在太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）中注射ds HIFa导致 HIFa在外套膜、鳃和血淋巴中显著降低[23]；You等使用RNAi技术干扰文蛤（Meretrix meretrix）原代消化腺细胞Ferritin基因，qPCR结果表明Ferritin基因的表达量与空白组相比下调了66.11%，WB结果表明蛋白水平下调了和20%[4]。该试验中PCR结果表明成功干扰了血和鳃细胞MyD88 基因，使其在试验组ds RNA组的表达量变低，而在对照组 EGFP ds RNA处理条件下其表达量与对照组基本上没有差异。相对于活体，原代培养细胞为研究软体动物基因功能的验证提供了较好的选择。

3.4 转染pEGFPN1质粒

梭华-Sofast介导质粒转染杂色鲍血淋巴和鳃原代细胞，结果发现转染后血淋巴细胞形态变差。这可能是因为血细胞分化程度高，在体外培养条件下存活时间较短；转染试剂可能对血细胞产生很大的毒性，造成细胞脱落。鳃细胞形态基本上没有变化，并且在转染后第5天可以见到荧光。鳃作为杂色鲍重要的呼吸器官在水中进行气体交换，会经常接触到有毒物质或者异物，其细胞具有较强的再生和修复能力[6，17，24]。这可能是鳃能够被转染而且可以在体外培养较长时间的原因之一。利用阳离子脂质体转染试剂通常在48 h 左右就能够检测到荧光，但是鳃细胞需要在第5天才能够检测到，并且效率不高。究其原因，包括以下方面：①原代细胞不适合用于转染；②鳃发挥其免疫功能，在一定程度上阻止转染试剂DNA复合物进入细胞内；③培养液的高浓度离子对转染造成影响；④需要利用转染效率更高的方法，如病毒介导的转染方法。

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