雨生红球藻中虾青素的提取工艺优化

李小慧　邹宁　孙东红等

摘要

[目的]探索大规模工业生产适用的虾青素提取方法。[方法]从原料的状态入手，采用常规的有机溶剂——丙酮作提取剂，对新鲜雨生红球藻膏和干藻粉中虾青素的提取率进行比较。[结果]使用目前采用的提取条件，从干藻粉中得到的虾青素提取率为新鲜藻膏的2倍多。[结论]烘干后的雨生红球藻在虾青素的提取中具有更大的优势。

关键词 雨生红球藻；虾青素；新鲜藻膏；干藻粉；提取工艺优化

中图分类号 S188 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2015）15-023-02

Optimization of Productional Astaxanthin Extraction Process from Haematococcus pluvialis

LI Xiaohui， ZOU Ning，SUN Donghong et al （Lu Dong Univercity of Life Science，Yantai，Shandong 264025）

Abstract [Objective]In order to explore the applicative extraction process of largescale production of astaxanthi. [Method] The different states of Haematococcus material were compared in this work. With conventional organic solvent as extracting agent， the extraction rates of astaxanthin from fresh paste and dry power of Haematococcus pluvialis were compared. [Result]The results showed that，at the current extraction conditions， the extraction rate of astaxanthin obtained from dry powder was about 2 times more than fresh paste. [Conclusion] Dry Haematococcus pluvialis had more advantages in Productional astaxanthin extraction process.

Key words Haematococcus pluvialis； Astaxanthin； Fresh paste； Dried powder； Optimization of extraction process

雨生红球藻中虾青素的含量高达1.5%～3.0%。虾青素是一种高效纯天然抗氧化剂，其主要作用是清除人体内的自由基，并能提高人体抗衰老能力。目前，人们公认的天然虾青素的生物来源有3种：虾、蟹等水产品的废弃物，红发夫酵母及雨生红球藻。其中，虾、蟹等水产品的废弃物中，虾青素不仅含量低，而且提取费用高；而天然红发夫酵母中虾青素的平均含量仅为0.4%；因此，雨生红球藻被确认为自然界中生产天然虾青素的最好生物来源[1]。其天然抗氧化性是类胡萝卜素的10倍、VE的550倍。因此，虾青素在保健食品、药品、高档化妆品、生物医药制剂以及饲料添加剂等领域有很大需求和应用前景。

近年來，随着对雨生红球藻研究的深入开发和发展，越发凸显出其经济和利用价值，其社会地位和开发价值也日趋上升。而目前最关键的是对虾青素的生产性提取工艺进行优化。大规模生产虾青素的提取费用很高，从而制约了利用雨生红球藻生产虾青素的开发和利用，因此，虾青素的提取工艺优化迫在眉睫。

在虾青素提取过程中，从雨生红球藻细胞中萃取虾青素是通过有机溶剂经细胞壁进入细胞，使色素溶解于有机溶剂中，从而通过扩散作用进入溶液，这是一种固-液萃取的过程。由于雨生红球藻的细胞壁很厚且存在胶质，阻碍了提取溶剂向细胞内渗透，加大了虾青素的提取难度。因此，在提取虾青素前要对雨生红球藻进行破壁处理，破壁效果的好坏直接影响到虾青素提取量的多少。笔者采用旋涡振荡破壁，在破壁过程中间歇振荡，为的是使细胞在振荡上浮之后重新下沉，使破壁更加完全。在破壁之前加入5～8粒小玻璃珠，保证破壁完全。依据前人研究虾青素的方法[2-14]，笔者用干藻粉和新鲜藻膏提取虾青素，比较虾青素的提取率。

1 材料与方法

1.1 材料

所用雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）藻种和新鲜藻液为鲁东大学大境藻类研究所提供。

1.2 仪器

分光光度计（UV2000）、快速混匀器（SK1）、移液枪（X40957）、恒温水浴锅（HHS）、电子天平（FA1104）、超净工作台、冰箱（BCD205TA）、显微镜（CX21）、台式离心机（TGL16C）

1.3 虾青素含量的测定方法 取样用分光光度计在可见光560 nm处测定其生物量，用血球计数板计数细胞数。经多次虾青素吸光度的标定，在波长为473 nm处，虾青素的吸光度达到峰值，因此，该试验虾青素的吸光度在波长473 nm下测定。

虾青素含量的测定步骤：①摇匀培养液， 用移液管分别吸取1 ml样液，置于洁净的离心管中编号1～4号，以4 000 r/min的速度离心5 min，弃去上清液，只保留沉淀。分别称取雨生红球藻干藻粉0.6 mg，分别编号5～8。 ②向第一步得到的沉淀和干藻粉各样品中分别加入1 ml 100%的丙酮，再加入等量的5～8个玻璃珠，在振荡混匀器上振荡混匀1 min，在振荡混匀过程中用铝箔包住离心管以避光。振荡完成后再加入2 ml提取剂，振荡混匀。

③将上述1～8号离心管先放入80 ℃的水浴中保温1 min，冷却至室温后再转移到0～4 ℃的条件下浸提1 h。④浸提后在4 000 r/min下离心5 min，取上清液，分别移至10 ml定容管中。⑤重复步骤②～④3次，将3次提取的上清液合并，每次分别移入相同编号的定容管中并定容至10 ml，混匀。在波长400～700 nm的可见光范围内测定吸光度，并记录测得的数值。

1.4 虾青素含量的计算方法 在473 nm波长下测定最大吸光值，提取剂作为空白对照。如果吸光值大于0.9，则必须对样品用提取剂稀释后再测定，并用下列公式计算所测溶液中虾青素的含量[15]：

类胡萝卜素质量（mg/g）= A473×25 ml（丙酮）×稀释倍数/250

虾青素（mg/g）=（类胡萝卜素质量（mg）×80%）/样品质量（g）

虾青素（g/L）= （类胡萝卜素质量（mg）×80%）/25 ml×8

1.5 鲜藻干重的测定方法

将称量纸置于培养皿中，于105 ℃下烘干24 h至恒重，记录称量纸的质量m1；用移液枪取4.5 ml的藻液于布氏漏斗中抽滤，同样置于培养皿中，于105 ℃下烘干24 h至恒重，记录其质量m2；

鲜藻的干重：m= m2-m1。

用该方法最终测得所用鲜藻的平均干重为（6.1±1.2）g/L。

2 结果与分析

雨生红球藻培养结束后其细胞密度的平均值为1×106个/ml，在波长560 nm下的OD值为0.123。

从雨生红球藻干藻粉和新鲜藻膏提取得到的虾青素含量见表1。从表1可以看出，干藻粉相比新鲜雨生红球藻膏虾青素的提取率及提取质量均提高了2倍多。由烘干后的雨生红球藻藻粉提取虾青素具有更大的优势。新鲜藻膏提取虾青素所用的藻液体积为1 ml，其干重为6.1 g/L，所提取的虾青素质量为0.136 mg/L，提取率为6.96 mg/g、干藻粉提取虾青素所用的干粉质量为0.6 mg，所提取的虾青素质量为0.300 mg/L，提取率为15.60 mg/g。

3 结论与讨论

（1）目前虾青素的提取主要是通过有机溶剂浸提的方法。原料状态的选择会影响虾青素的提取速率。因为烘干后的干藻粉和新鲜藻膏在提取时细胞所处的环境不同，因此提取虾青素的效果也不同。虾青素不溶于水，用新鲜藻膏来提取虾青素，有水分的存在下，会影响破壁的效果和虾青素的提取效率，同时加入有机溶剂亲水性差，不容易进入细胞，所以提取率不高。而烘干后的干藻粉，细胞处在无水的条件下加入有机提取剂，则细胞容易破壁，虾青素容易溶入有机溶剂中，因此，提取率较高，提取效果好。

（2）试验所用藻液的体积为1 ml，其干重为6.1 g/L，所用干藻粉的质量为0.6 mg，提取剂均用丙酮作有机溶剂。经计算得到新鲜藻膏提取虾青素的含量为6.96 mg/g，虾青素的质量为0.136 mg/L；固体干藻粉得到的虾青素含量为15.6 mg/g，虾青素的质量为0.300 mg/L。比较发现，干藻粉相比新鲜的雨生红球藻虾青素的提取率及提取含量均提高了2倍多。烘干后的雨生红球藻在虾青素的提取中具有更大的优势。

（3）从雨生红球藻中提取虾青素，通常都是用新鲜的藻膏进行提取，该研究用烘干后的藻粉和新鲜的雨生红球藻进行试验，通过对虾青素提取率的比较得出，用烘干后的雨生红球藻，其虾青素的提取率及提取含量都比用新鲜藻膏提取的高。

（4）丙酮是虾青素提取中较常用的提取剂，操作方法也较成熟，是目前有机溶剂中提取率较高的溶剂。因此该试验选取丙酮作提取剂，保证虾青素较高的提取率，然后再对其进行新鲜藻膏和固体干藻粉的比较，且新鲜的藻膏不宜储存、易污染，虾青素易氧化，而干藻粉则相对易保存和运输，对今后的大规模生产具有参考价值。

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