细胞内自由基的类型及产生机制

方帜　薛波　刘龙洲等

摘要 自由基的过度产生是机体过氧化损伤、代谢紊乱和抗氧化失衡的主要原因。该研究主要阐述了自由基的类型和产生机制，同时阐明了动物骨骼肌和消化道自由基的来源。

关键词 自由基；类型；产生机制

中图分类号 S8-0 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）15-020-03

Free Radical Types in Cells and Generation Mechanism

FANG Zhi， XUE Bo， LIU Longzhou， YANG Ye*

（College of Animal Science， Yangtze University， Jingzhou， Hubei 434025）

Abstract The overproduction of free radical is the main reason of peroxidation damage， metabolic disturbance and antioxidant imbalance. The types and generation mechanism of free radical were elaborated， as well as source of free radical in muscle skeleton and digestive tract in animal.

Key words Free radical； Type； Generation mechanism

自由基（Free radical，FR）通常指独立存在的带有未成对电子的原子、原子基团、分子或离子。自由基不仅是需氧生物体在正常条件下的新陈代谢过程中产生，而且在受到各种刺激因子（环境温度、机械、病原）的作用下会在短时间内大量产生。机体内大量自由基的产生是动物应激和亚健康、生产性能下降的主要原因。

1 自由基的类型

自由基是细胞内通过失去一个电子或得到 一个电子而产生。这些自由基通常是在细胞融合、细胞裂解或氧化还原反应的过程中产生带电或不带电的自由离子。活性氧（ROS）不仅包括氧中心自由基，而且包括氧的反应衍生物的非自由基（如H2O2）。活性氮（RNS）是指氮自由基和其他反应分子。这些分子中含有氮。因此，活性氧氮分子（RONS）是ROS、RNS的总称，包括自由基和非自由基。

细胞内主要的自由基是过氧化物（O-2·）和一氧化氮（NO）。O-2·是在电子传递系统中氧的不完全还原反应产生或作为酶系统的特殊产物；而NO是有酶促反应产生。O-2·和NO都具有活性，能很容易地反应生成其他ROS和RNS[1]。以下是一些主要的ROS和RNS及其副产物。

O-2·带负电，不容易透过细胞膜，一般是体内生化反应的中间产物。与其他自由基相比，O-2·活性相对较低，但是它能快速地与NO和蛋白质里的FeS基团作用。作为具有氧化反应活性的离子，O-2·能还原一些生物物质（如细胞色素C），氧化一些物质（如抗坏血酸）。细胞内O-2·的歧化作用（如自发的和过氧化物歧化酶催化的）可以产生一些过氧化氢（H2O2）。

1.2 H2O2

H2O2是一种非自由基ROS，能产生自由基如羟基自由基（OH·）。H2O2比较稳定，能穿过细胞膜，且具有较长的半衰期，其氧化性比较弱，但在细胞质内的氧化性很高。过氧化氢歧化酶和氨基酸氧化酶产生的H2O2不能直接氧化DNA或脂质，但能使一些酶失活[2]。H2O2毒性主要是它能通过金属催化反应产生OH·，如Fenton反应。

H2O2+Fe2+→Fe3++ OH·+ OH-

从细胞生物学来说，这个反应是HaberWeiss反应非常重要的一部分。由于Fe或Cu通过过氧化物保持一种还原状态，催化H2O2形成羟基自由基。

O-2·+ H2O2金属催化OH·+ OH-+O2

即如下细胞反应：

1.3 OH·

OH·具有强氧化性和强反应性。因此，OH·能损害与其紧密接触的分子。它们具有很高的反应性，不能穿过细胞膜，是对生物物质最具破坏性的ROS。

1.4 单线态氧（Singlet oxygen）

单线态氧是一种电子活性氧，但不是自由基。它不含有未配对电子，具有很短的半衰期，但具有擴散性，易穿过细胞膜。单线态氧存在于2种形态：①第一激活状态（1ΔgO2）；②具有更高反应活性的第二激活状态（2∑gO2）。这种ROS没有自旋限制，所以其氧化稳定性很高。生物系统中过氧化阴离子的歧化作用能形成单线态氧。

1.5 NO

NO在许多细胞内是通过L精氨酸而形成的。这个合成作用通过神经NOS（nNOS）、内皮细胞NOS（eNOS）、诱导性NOS（iNOS）3种NO合成酶（NOS）。每种NOS都能在NADPH作用下把L精氨酸转化为NO和L瓜氨酸。

NO能结合过渡态金属，细胞内其主要作用是具有结合鸟甙酸环化酶中的Fe离子的能力。它激活鸟甙酸环化酶，促进cGMP的产生。NO与Fe的结合是NO发挥作用的重要机制，同时通过结合血红蛋白中的铁使其在失活和消除的过程中发挥重要作用。NO具有弱还原性，能与氧反应形成NO2，与过氧化物快速反应形成亚硝酸盐[3]。

1.6 亚硝酸盐（Peroxynitrite）

O-2·与NO反应形成亚硝酸盐，其速度比O-2·的歧化作用形成H2O2的速度快3倍，甚至比NO与血红素蛋白的反应速度还快。这是NO与O-2·存在时的主要反应。亚硝酸盐（或其质子化产物ONOOH）具有强氧化性，能导致氢硫基的损耗、DNA损害和蛋白质的硝化。

O-2·+NO·→ONOO-

1.7 超氯化物（Hyperchlorite）

超氯化物是H2O2在过氧化物酶的作用下形成的。超氯化物一般通过嗜中性白细胞形成，通过氧化氢硫基、脂质、抗坏血酸而产生第二产物，对许多生物活性分子具有破坏作用。另外，其酸性形式（如次氯酸）能穿过细胞膜，促使蛋白质的破裂和聚集。

H2O2+Cl-→HOCl+ OH-

2 骨骼肌自由基和过氧化物的产生机制

肌纤维内的不同细胞部位都会产生O-2·。不论是肌肉收缩活动，还是肌肉延伸活动，都会增加肌纤维里过氧化物的产量。图1说明了骨骼肌里自由基和O-2·产生的过程[1]。

2.1 线粒体（Mitochondria）

线粒体是肌纤维ROS产生的主要部位[4]。线粒体消耗了2%～5%的氧，一个电子还原就会产生一个过氧化物。最近研究确定了线粒体内过氧化物产生的主要部位。在呼吸链复合物体I系统中，O-2·主要由FeS 复合物反应产生，而在呼吸链复合体II系统中，O-2主要由半醌Q10反应产生。在复合体III系统中，线粒体内膜空隙和线粒体基质都是释放O-2·的主要部位。另外，线粒体在基础呼吸阶段（阶段4）所产生的ROS量远远多于在激活呼吸阶段（阶段3）。与I型肌纤维相比，II型肌纤维能提高ROS产量。II型肌纤维产生ROS的量估计是I型肌纤维的2～3倍。

2.2 肌质网（SR）

骨骼肌NAD（P）H优先使用NADH作为底物，NAD（P）H氧化酶在肌肉收缩时会释放过氧化物，而NAD（P）H氧化酶位于SR。这些酶所产生的ROS能通过氧化Ryanodine受体而影响SR对Ca的释放。

2.3 横肌束（Transverse tubules）

骨骼肌横肌束含有NAD（P）H氧化酶，其活性在去极化后会增加。在吞噬细胞中的NAD（P）H氧化酶含有一些亚基单位。这些亚基单位会释放O-2·到骨骼肌的细胞液中。

2.4 肌膜（Sarcolemma）

所有细胞都含有质膜氧化还原体系。该质膜产生的电子会穿越质膜，肌膜含有NAD（P）H氧化酶复合体，在巨噬细胞中的这些酶都含有4个亚基（gp91phox、p22phox、p47phox、p67phox），且所有这些亚基都与细胞膜有关。

除了NAD（P）H氧化酶，质膜上还有其他氧化还原系统。这些系统能把电子从细胞内的还原物转移到胞外的电子受体上。电子从胞质NAD（P）H转移到质膜上。这种转移可能是通过NADH细胞色素 b5 氧化还原酶，或通过NAD（P）H醌氧化还原酶（NQO1）。通过一系列的过程，细胞内NAD（P）H可以作为基质在细胞表面产生过氧化物。

2.5 PLA2依赖性过程

磷脂酶A2（PLA2）分解细胞膜上磷脂而产生花生四烯酸。花生四烯酸是ROS生成酶如脂肪氧合酶的底物。另外，PLA2的激活可以增加NAD（P）H氧化酶活性。PLA2酶活性的增加可以促进肌肉线粒体、细胞液ROS的产生，并把ROS释放到细胞外间隙。Ca依赖性和非依赖性的PLA2都参与肌肉ROS的形成，而Ca非依赖性PLA2（iPLA2）主要促进骨骼肌细胞细胞质内氧化物的形成。14 kDa的Ca依赖性PLA2（sPLA2）位于线粒体内，在肌肉收缩过程中促进细胞内ROS的形成。在非骨骼肌细胞中，另外一种Ca依赖性PLA2异构体——细胞质PLA2（cPLA2）与ROS的形成有关。研究表明，在休息时，ROS来自于Ca-非依赖性PLA2，而在肌肉收缩时，ROS主要来自于激活的Ca依赖性PLA2。

2.6 黄嘌呤氧化酶（XO）

XO可以增加骨骼肌里ROS的产生。小鼠骨骼肌里含有大量的XO，而人类骨骼肌里黄嘌呤脱氢酶或氧化酶的活性很低。

2.7 NO的产生

在一般情况下，骨骼肌会表达NO合成酶（NOS）异构形式的神经NOS（nNOS）和内皮NOS（eNOS）。nNOS在快速收缩肌肌膜处表达较多，而eNOS多位于肌肉线粒体。在炎性条件下肌肉也会表达iNOS，但在正常肌肉中的作用不大。对培养的细胞肌管进行研究，发现骨骼肌细胞在收缩活动时释放的NO增加[5]。

3 动物肠道自由基的产生机制

在细胞正常新陈代谢和先天免疫反应过程中，同时会产生ROS——自由基。首先，肠上皮细胞的主动新陈代谢本身就是ROS的来源，其生成与电子传递链的活性有关[6]，所产生的活性物质包括O-2·、H2O2和OH·。它们都是线粒体中氧化磷酸化过程中的产物[7]。在线粒体内，来自于底物的电子通过电子传递链（ETC）由复合物I和II（CI和CII）传递到氧，形成H2O，并且通过质子泵使得质子穿过线粒体内膜。葡萄糖经过三羧酸循环作用（TCA）产生电子供体。主要的电子供体是NADH，给复合物I提供电子，另外一个电子供体是FADH2，给复合物II提供电子（图2）。

其次，肠道先天及获得性免疫系统在与许多共生物和病

原微生物反应过程中产生的NO。它与O-2·作用产生过氧亚硝酸阴离子（ONOO-），其较长的半衰期以及较高的脂溶扩散性使得活性氮代谢物的损伤更大[8]。

肠黏膜上皮组织及细胞受到病原微生物刺激后，会产生活性氧自由基（ROS）。病菌诱导的肠道细胞ROS主要是由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶家族（NOX）催化合成，其中主要是NOX1 和双氧化酶（DUOX）。在肠道受到病原微生物侵染时，吞噬细胞细胞膜中存在的NADPH 氧化酶（还原型辅酶氧化酶）可被激活而急剧产生氧的消耗，并产生一定量的O-2·。除O-2·之外，中性粒细胞所产生的组织损害因子还有蛋白酶、弹力蛋白酶以及由乳铁蛋白一铁所产生的OH·，可使酶类及非酶类的物质还原，并且产生反应性更高的活性氧（H2O2、OH·、ClO-）。这些ROS会引起严重的炎症反应，造成肠黏膜损伤，病原菌释放游离的尿嘧啶碱基作为信号分子，通过G蛋白偶联受体（GPCRs），激活肠黏膜上皮细胞中的DUOX，诱导合成大量ROS[9]。

益生菌也能刺激肠道产生少量的ROS。益生菌的诱导肠道细胞产生ROS的机制与致病菌完全不同。它通过细胞壁上肽聚糖分子中的N甲酰肽作用于肠黏膜细胞膜上的甲酰肽受体（FPRs），激活细胞中的NOX1，合成一定量的ROS[10]。益生菌能够通过刺激肠道吞噬细胞膜上的FPRs，激活NOX2，诱导机体肠道吞噬细胞产生ROS。乳酸杆菌能够通过激活NOX1诱导肠道组织产生、释放ROS。益生菌也能够通过产生可溶性蛋白成分，诱导宿主肠道合成一定量的ROS。

安徽农业科学 2015年

参考文献

[1] POWERS S K，JI L L，KAVAZIS N K.Reactive oxygen species：impact on skeletal muscle[J].Compr Physiol，2011，1（2）：941-969.

[2] HALLIWELL B，GUTTERIDGE J.Free radicals in biology and medicine[M].Oxford：Oxford Press，2007：936.

[3] HALLIWELL B.Free radicals and antioxidants：a personal view[J].Nutr Rev，1994，52：253-265.