SkinEthicTM重组皮肤模型对无水乳液的刺激性评估

郑立波　李丽　张小慧　尹慧　刘艳红　董银卯

近年来，随着欧盟对动物实验的取缔，体外替代实验逐渐引起人们的广泛关注。本文利用SkinEthic^TM重组皮肤模型对无水乳液的刺激性进行测试。实验结果表明：该实验条件下所测得的数据符合OECD规定。10%Vc油包醇体系、10%Vc油包水体系、纯油体系样品对SkinE也ic^TM重组皮肤模型显示无刺激性。

自2009年3月欧盟正式公布禁止使用动物进行化妆品毒性和过敏实验，体外代替实验逐步引起人们的广泛关注。1975年Rhein Waldg和Green通过培养上表皮细胞，成功获得皮肤模型，并成功用于皮肤缺损创面的治疗。从此，皮肤模型得到了长足的发展。研究报道多应用于化学品、化妆品的刺激性、腐蚀性实验、功效性评价、透皮吸收性等方面的研究。2013年7月26日，经济合作与发展组织（Organization for EconomicCo-operation and DevelopmentOECD）对皮肤模型的具体要求及操作方式提出了新的更具体的要求，使得皮肤模型逐步商业化，操作更加具体化。

皮肤模型的优势如下：可测定化合物经皮吸收后对皮肤内部细胞的影响；重复性高：取自不同人群的皮肤，更具说服力；适用于各种剂型药物；可部分替代动物刺激性实验，减少舆论；灵敏度、特异性高和精确性好。

无水乳化体系主要包括油包多元醇、油包油体系。无水乳液作为一种新的化妆品剂型，在国内鲜有报道，国外对无水乳液的报道也较少，多数是对于药物缓释、物质稳定性方面的报道。无水乳液有下列优点：①对功效成分具有缓释的效果；②能够溶解水不溶性或在水中不稳定的功效成分；③内相承载物质后能够与外相分割，防止与空气接触后发生氧化变性；④通过外层对油相的包裹，滋润效果更好；⑤在药物制剂中，很多功效成分溶于水后有难以下咽的味道，无水乳化对于婴儿或者难以下咽药片的老人有很好的帮助。

近年来，由于无水体系的诸多优点，人们也开始对这一配方体系进行研究。但无水乳液不溶于水这一性质致使其安全性不适合细胞实验进行评价。重组皮肤模型适合于检测各种剂型的化妆品，化学品。所以，本文采用SkinEthic^TM重组皮肤模型对无水乳液的刺激性进行研究。为以后3-D皮肤模型应用与化妆品的安全性检测提供参考。

材料与方法

1.材料

SkinEthic^TM（购于美国MatTek公司）、含10%Vc的硅油包多元醇无水乳液、含10%Vc的硅油包水乳液、功能油（三个样品均由北京工商大学研制）

2.仪器与试剂

*仪器：4℃的冰箱[MBR-107D（H）]、二氧化培养箱（ThermoForma 3111）、超净工作台[MCV-B91S（T）/Bgl F（T）]，倒置显微镜（OlymPuslX5）、不同量程移液枪（德国Eppendorf），酶标仪（BiokitELX800）*试剂耗材：标准细胞培养基和相应的缓冲液（Sigma）、胰酶（ScienCell）、DPBS、异丙醇（Sigma）、MTT实验所需耗材、细胞培养瓶（T175）、尼龙布，无菌钳，一次性灭菌移液管、吸管，6孔板、24孔板、96孔板。

3.试验方法

（1）样品准备：5%SDS为阳性对照，DPBS为阴性对照。选取6个测试样品待用。

（2）收到样品当天应检查皮肤是否完整，有无异常，将DPBS置于（5±3）℃冰箱中，将MTT溶液置于（-20±5）。℃冰箱中。

（3）将皮肤模型用无菌钳取出后用纱布蘸取其底部的多余琼脂糖后将其置于空的24孔板中。检查皮肤是否完整，将表面多余的水分尽量吸干。此过程应在5min之内完成。

（4）培养基预热至20～25℃，在6孔板中加入0.9mL的培养基，用无菌钳取出皮肤后将皮肤模型转移到6孔板中。在（37±1）℃，（5±1）%培养（60±5）min（使其中的固定物释放）。将皮肤模型转移到新的含0.9mL培养基的6孔板中，在（37±1）℃，（5±1）%CO₂条件下培养（18±3）h。

（5）将皮肤模型转移到含新的0.9mL培养基的6孔板中，用尼龙布将皮肤表面的液体吸净。

将受试物加至人造皮肤模型表面（固体先加25uL蒸馏水后加25mg样品，液体吸取30μL样品）后，加一层尼龙布，使样品分散均匀。用接种环将样品分散均匀。每个样品做三个平行试验。将样品放在（37±1）℃，（5±1）%CO₂条件下孵育35min后将皮肤从培养箱中取出，直到皮肤与样品接触60min为止。

（6）样品暴露（60±1）min后，立即用DPBS多次冲洗组织。后用尼龙布将皮肤表面的DPBS吸净，将其换入新的含0.9mL培养基的6孔板中培养（24±2）h。

（7）（24±2）h后收集培养基，置于24孔板中，利用试剂盒测定其白介素含量。同时将皮肤转移到新的含0.9mL培养基的6孔板中继续培养（18±2）h。

（8）培养液后将皮肤组织进行冲洗后转移到300uL的MTT溶液中避光保存，进行MTT染色。

（9）MTT染色后，去除MTT溶液，用DPBS冲洗两次，将皮肤转移到2mL的异丙醇中。提取细胞中的甲躜。

（10）将提取液转移到96孔板中，在550～570nm下测定吸光度。受试物的吸光度与阴性对照比较。以样品相对于阴性对照的细胞存活率的变化来评估受试物的潜在刺激性。

相对细胞活率百分数=（样品平均吸光度值/阴性对照的平均吸光度值）×100%

4.判定标准

（1）阴性对照可接受的标准为：在570nmT其OD值X应满足1.0

（2）阳性对照与阴性对照组细胞存活率的比值应<20%

（3）各个样品的SD<18%

（4）在上述情况下其细胞活率若>50%为无刺激，细胞活率若≤50%为有刺激。

实验结果

如下图所示：为检测化学品、化妆品刺激性的实验方法之一。本次实验检测了3种产品对SkinEthic^TM重组皮肤模型的刺激性，最终判断了10%Vc油包醇体系，10%Vc油包水体系、纯油体系对SkinEthic^TM重组皮肤模型无刺激性。

由图1可知，阴性对照组在570nm下其OD值×=2.2534<20%；阳性对照与阴性对照组细胞存活率的比值=3.3616/99.9978×1D0%=3.3617%<20%；其中各个样品的SD<18%，所以，上述实验结果符合OEcD规定。利用MTT实验测得其细胞活率分别为97.90%、107.11%、120.65%，所以判定10%Vc油包元醇体系、10%Vc油包水体系、纯油体系对SkinEthic^TM重组皮肤模型无刺激性。

讨论

体外重组皮肤模型是取自人体具有增殖能力的细胞后，种植于具有生物兼容性的高分子材料中，通过原代培养，获得具有类似于人体皮肤的模型结构。根据其皮肤模型所含皮肤的层数及深度，主要包括单层细胞模型、表皮模型，复层皮肤模型。其中，复层皮肤检测模型结构复杂，是研究实验动物皮肤刺激实验替代的理想模型。通过本次实验可知：在此条件下，SkinEthic^TM重组皮肤模型可以满足OECD的各项规定，可作为以后皮肤模型在化妆品刺激性方面的应用提供参考。