应用IHA与竞争ELISA方法检测猪瘟免疫抗体的比较与分析

汤海平　林永乐　林跃华　王艺娟（福建省漳州市动物疫病预防控制中心，福建漳州363000）

猪病防控Swine Disease Prevention and Control

应用IHA与竞争ELISA方法检测猪瘟免疫抗体的比较与分析

汤海平林永乐林跃华王艺娟
（福建省漳州市动物疫病预防控制中心，福建漳州363000）

摘要：通过对300份猪血清样品应用正向间接血凝试验（IHA）与酶联免疫吸附试验（竞争ELISA）方法进行猪瘟免疫抗体检测。采用IHA方法，以抗体效价≥25为合格标准时，其抗体合格率为95.3%；采用竞争ELISA方法，以阻断率≤50%为阳性标准时，其抗体阳性率为93.6%，两种检测方法总体一致符合率93.0%，经X2检验，两者差异不显著，说明IHA方法和竞争ELISA方法皆可用于检测猪瘟免疫抗体水平。

关键词：猪瘟；免疫抗体；IHA；ELISA

猪瘟是国家要求强制免疫的动物疫病之一，疫苗免疫效果关系着猪群是否被保护而不受感染，因此，选择正确的检测方法对猪瘟免疫抗体效价进行检测并科学评估较为重要。基层兽医实验室通常采用正向间接血凝试验(IHA)检测猪瘟免疫抗体，而上层兽医实验室则多数采用酶联免疫吸附试验(ELISA)。为了获得IHA和ELISA两种检测方法之间存在的关系，减少因检测方法不同而出现的结果差异，笔者对300份猪血清样品进行猪瘟免疫抗体水平的平行对比检测，并详细比较这两种常规检测结果，为正确合理地评价猪瘟疫苗免疫抗体水平提供参考。

1　材料与方法

1.1免疫疫苗种类

猪瘟传代细胞苗，哈药集团生物疫苗有限公司生产，批号：201402～201405。

1.2被检血清

样品来源于福建省漳州市各县（市、区）抽检的2014年秋季强制免疫过2次猪瘟疫苗的猪血液样品300份，实验室分离血清，置4℃冰箱保存待检。

1.3诊断试剂

猪瘟间接血凝抗体检测试剂盒（配套有抗原、阳性血清、阴性血清及稀释液）购自中国农业农科院兰州兽医研究所诊断中心，批号：2014112105；猪瘟抗体ELISA检测诊断试剂盒购自法国ID.VET公司，LOT：626。

1.4仪器设备

德国Brand单道、多道微量移液器；奥地利TECAN公司酶标仪，型号为Infinite M200PRO。

1.5检测方法与判定标准

IHA试验，依据《猪瘟诊断技术规程》（NY/SY 156-2000）和中国农业农科院兰州兽医研究所提供的使用说明书进行操作。判定标准：其免疫抗体≥1∶16（第4孔），呈现“++”凝集为免疫合格；按《2014年福建省动物疫病监测与流行病学调查计划》的通知文件要求，免疫个体在免疫21天后，抗体阻断ELISA方法和抗体间接ELISA方法检测抗体阳性即判定为合格，抗体正向间接血凝试验抗体效价≥25判定为合格，以文件要求作为此次判定标准。

ELISA试验按ID.vet公司的竞争ELISA试剂盒说明书进行操作，检测波长为450 nm，判定标准：S/N（%）=ODsp/ODnc×100，S/N≤50%为阳性、50%＜S/N≤60%为可疑、S/N＞60%为阴性，本试验以S/N≤50%为阳性、合格，以S/N＞50%为阴性、不合格。

2　检测结果

2.1猪瘟抗体IHA与竞争ELISA检测结果的对比

在300份血清中，IHA方法检测合格率为95.3% （286/300）；而ELISA方法检测阳性率为93.6% （281/300）。两种检测方法合格（阳性）样品一致符合率为95.4%（273/286）；样品总符合数279份，一致符合率为93.0%（279/300），见表1。

表1　猪瘟抗体IHA与竞争ELISA检测的对比结果（份))

2.2猪瘟抗体IHA的log2值与ELISA的阻断率对比

根据IHA检测抗体的log2值由低到高排序，对应ELISA检测抗体阻断率，找出两种检测方法的共同合格（阳性）样品数，计算阳性符合率，详见表2。

表2　IHA的效价（log2值)与ELISA的阴阳性对比结果

2.3部分样品IHA的log2值与ELISA的阻断率比较

在抗体检测过程中，发现三组数据有较明显不同，序号1～10样品为散养的中猪血清，猪瘟抗体IHA效价log2值为10，竞争ELISA的阻断率在30%～45%之间；序号11～20样品为规模猪场的母猪血清，IHA效价log2值为8，竞争ELISA的阻断率在7.0%～8.0%之间；序号21～40样品为散养的中猪血清，IHA效价log2值为3～8之间，竞争ELISA的阻断率在8.0%～32.0%之间，详见表3。

3　结果分析与讨论

⑴从表1可以看出，按文件要求的判定标准时，IHA的检测合格率为95.3%，比竞争ELISA的检测阳性率（93.6%）高1.7个百分点，经统计学X2检验，两种检测方法差异不显著（＞0.05），说明IHA方法的合格率与竞争ELISA方法的合格率差异不明显，其结果与戴爱玲等[1]、赵鑫[2]等的试验结果一致。两种检测方法的样品总符合数279份，总符合率为93.0%，合格（阳性）样品符合率95.4%，结果表明，总体上符合率均达到93%以上，两者有很好相关性，这与何雁南等的试验结果一致[3]。

⑵从表2可以看出，在IHA抗体log2值升序的各个区域值，竞争ELISA抗体检测结果均出现阳性和阴性，但两者合格（阳性）符合率很高，在91.7%～100%之间；另外竞争ELISA检测抗体阳性符合率并没有随着IHA抗体log2值的升高而升高，说明两种方法之间还是存在一些不一致性。

⑶从表3中分析三组IHA和竞争ELISA的检测数据差异甚大的原因，主要是与疫苗剂量和免疫后抽血间隔时间有关。序号1～10的样品是免疫2.5头份疫苗（两次免疫剂量一样）的中猪血清，抽血时间距最后一次免疫仅间隔20天，产生的中和抗体水平很高（10 log2值），但产生抗E2蛋白抗体水平则一般，竞争ELISA检测阻断率较高（30%～45%）；序号11～20的样品是免疫4头份疫苗（跟胎免疫）的母猪血清，多次免疫后产生的中和抗体水平也是很高（8 log2值），抗E2蛋白抗体水平也高，体现在竞争ELISA检测阻断率很低（6.0% ～8.0%）；序号21～40的样品是免疫1.5头份疫苗（两次免疫剂量一样）的中猪血清，抽血时间距最后一次免疫间隔50天，由于免疫剂量仅为1.5头份，产生的中和抗体水平不是很高（3～8 log2值之间），且参差不齐，产生抗E2蛋白抗体水平则不错，竞争ELISA检测阻断率较低（8.0%～50.0%），也参差不齐。这三组试验结果表明IHA与竞争ELISA更没有特定相关性[1,4]。

⑷本次试验结果表明，采用IHA方法检测猪瘟免疫抗体合格率略高于竞争ELISA检测的阳性率，是因为IHA和竞争ELISA检测方法原理机制有所不同，IHA检测的是猪瘟疫苗免疫后血清中的全病毒抗体，竞争ELISA检测的是血清中E2蛋白产生的抗体。全病毒抗体可能是含有其他抗体的中和抗体，如BVDV抗体等；抗E2蛋白抗体则是猪瘟疫苗免疫后产生的，是猪瘟病毒的主要抗原蛋白,具有种属特异性，因此，血清中全病毒抗体的量会多于单一抗体。

表3　部分IHA的log2值与ELISA的阻断率比较

4　小结

⑴通过本次试验比较,一方面，IHA的检测合格率95.3%高于ELISA的检测阳性率93.6%，两种检测方法无统计学上的差异，说明IHA与竞争ELISA检测方法有很好的相关性[1]，但另一方面，单个样品中也会存在明显差异，证实两者之间没有特定关联性[4]。

⑵本试验结果表明，基层采用IHA方法评价猪瘟免疫抗体是可行的，但因肉眼判定，主观性误差较大，而ELISA检测由仪器自动读取，误差小；从诊断试剂的稳定性上看，ELISA试剂性能稳定、重复性好，IHA试剂性能不够稳定，重复性差[1,2,4]；即两种方法各有优缺点，要因地制宜采用。

参考文献

[1]戴爱玲,要晓华,杨小燕,等.间接血凝试验与酶联免疫吸附试验检测猪瘟抗体的比较.见:福建省畜牧兽医学会.福建省畜牧兽医学会2009年学术年会论文集[C].福州:福建省农科院畜牧兽医研究所. 2009. 123-125.

[2]赵鑫,赵明娟,高洋,等.两种检测猪瘟免疫抗体实验对比试验[J].当代畜牧, 2014(9):53-54.

[3]何雁南,栾后利,董晓辉,等.检测猪瘟抗体间接ELISA方法的建立及应用[J].养殖与饲料, 2007(7):5-8.

[4]王治方,郭成留,张清华,等.两种不同方法对猪瘟免疫效果评估对比试验[J].中国畜牧兽医, 2007, 34(9):99-100.

中图分类号：S858.28

文献标识码：A

文章编号：1673-4645(2015)10-0047-03

收稿日期：2015-05-22

作者简介：汤海平（1965-），汉族，福建云霄人，高级兽医师，长期从事动物临床兽医和实验室检测工作，E-mail:thp2@163.com