川芎嗪对急性脑梗死模型大鼠硫化氢、血浆胆红素和氧化低密度脂蛋白水平变化及意义

张国珍,郑维红,梁戎

(1.内蒙古自治区人民医院 干部保健所，内蒙古 呼和浩特 010017；2. 厦门大学附属中山医院 神经内科，福建 厦门 361004)



川芎嗪对急性脑梗死模型大鼠硫化氢、血浆胆红素和氧化低密度脂蛋白水平变化及意义

张国珍1,郑维红2Δ,梁戎1

(1.内蒙古自治区人民医院 干部保健所，内蒙古 呼和浩特 010017；2. 厦门大学附属中山医院 神经内科，福建 厦门 361004)

目的 探究川芎嗪对急性脑梗死模型大鼠硫化氢、血浆胆红素和氧化低密度脂蛋白水平变化及意义。方法 健康的SD大鼠100只，体质量(250±30)g，雌雄不限，随机分为5组(对照组、假手术组、模型组、西药组和川芎嗪组)，每组20只，实验各组用线栓法制备局灶性脑缺血模型。正常组、模型组与假手术组，1次/天静脉注射无菌生理盐水10 mL，川芎嗪组静脉注射川芎嗪注射液10 mL /(kg·d)，西药组静脉注射阿托伐他汀注射液10 mL /(kg·d)，在实验第10天时处死一半大鼠检测相关指标，第20天时，处死余下各组大鼠。取血检测硫化氢、血浆胆红素和氧化低密度脂蛋白水平，取脑观察其病理学改变。结果 与对照组及假手术组相比，川芎嗪组和西药组H2S及血浆胆红素水平均有明显上升，差异具有统计学意义(P<0.05)；治疗20d后，与西药组相比，川芎嗪组H2S及血浆胆红素水平上升更为显著(P<0.05)。与对照组及假手术组相比，川芎嗪组和西药组Ox-LDL水平均有明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；治疗20 d后，与西药组相比，川芎嗪组Ox-LDL水平下降更为显著(P<0.05)。各组大鼠脑组织病理学切片显示：川芎嗪组：少数神经细胞死亡,细胞质疏松及肿胀明显减轻；西药组:细胞核少见固缩，脑组织水肿有减轻；模型组大鼠:脑组织周围神经元肿胀并出现皱缩，细胞核固缩，梗死灶内细胞和血管坏死，正常组织消失，结构模糊、间质水肿；对照组及假手术组大鼠:细胞形态正常，分布均勾，未见皮质部苍白梗死。结论 川芎嗪能够升高急性脑梗死模型大鼠硫化氢、血浆胆红素水平，升高氧化低密度脂蛋白水平，对临床具有指导意义。

川芎嗪；急性脑梗死；硫化氢；血浆胆红素；氧化低密度脂蛋白

脑梗死是由于供应脑组织的动脉发生病变所导致的疾病，常伴偏瘫、失语、偏盲、意识障碍甚至死亡[1]，约占全部脑血管病的 75%[2]。急性脑梗死指脑缺血发生在6～12 h之内，缺血区脑组织苍白、轻度肿胀，神经细胞、胶质细胞及内皮细胞呈明显缺血改变[3]。缺血性脑血管病的主要病理基础为动脉粥样硬化(arteriosclerosis，AS)。目前 AS 的发病机制尚不完全清楚，近年来的研究显示血脂水平和动脉粥样硬化病变的程度之间的关系十分密切，而血浆水平的脂质水平升高能够促使动脉粥样硬化形成[4]。川芎是一种常用中药，随着人们对其研究的深入，川芎嗪在预防和治疗多种疾病方面的药理作用及临床应用非常广泛，研究发现其提取物川芎嗪有抗血小板聚集、扩张小动脉、改善微循环和脑血流的作用[5]。在治疗闭塞性血管疾病、脉管炎、炎症、冠心病等。抗癌，保护肝肾，保护神经等方面都有较好的疗效，但在治疗急性脑梗死方面的研究较少，为了探索治疗急性脑梗死的新思路，改善其预后，笔者通过研究川芎嗪对急性脑梗死模型大鼠硫化氢、血浆胆红素和氧化低密度脂蛋白水平变化及意义来探究川芎嗪对于治疗急性脑梗死的疗效，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康的SD大鼠100只，体质量(250±30)g，7～8周龄，雌雄不限，自由摄食及饮水，饲养室环境温度23 ℃ ，相对湿度70%。本实验遵循《动物实验保护条例》。

1.2 试剂及仪器 川芎嗪注射液(北京市燕京药业有限公司，国药准字H20043160)；阿托伐他汀注射液(辉瑞制药有限公司，国药准字J20120050)。日立7170S生化分析仪；美国ADL公司生产ELISA试剂盒；高速低温离心机(TGL20M)；全自动酶标仪(Bio-Tek Elx800)。

1.3 实验方法

1.3.1 模型的建立：采用改良的Zea Longa法[6]制作MACO手术，线栓法制备局灶性脑缺血模型，随机选取60只大鼠，术前12 h停饲，将大鼠用10%腹腔内注射3 mL/kg水合氯醛麻醉，待其无翻正反射后，头仰位四肢固定于手术台上，消毒后颈部正中剪开长约20～25 mm皮肤，显微镜下游离颈内动脉(ICA)，右侧颈总动脉(CCA)和颈外动脉(ECA)，近心端依次结扎CCA、ECA,结扎翼腭动脉(PPA)，用微动脉夹分别夹住CCA近心端和ICA，然后在距CCA分叉近心端5 mm处剪一小口，去除动脉夹，将栓线向ICA方向顺利插入约18～20 mm，有明显阻力感时停止插入，松开PPA微动脉夹，剪去线栓尾端部分，系牢ICA以固定尼龙线，逐层缝合皮下组织及皮肤并用青霉素局部消毒。术后将大鼠保持侧卧位，保持呼吸道通畅，监测体温在37 ℃左右并注意保暖。

1.3.2 假手术组大鼠模型的建立：假手术组大鼠将栓线由ECA断端插入ICA，保留约1 min后将栓线拔出,将结扎ECA断端，逐层缝合皮下组织及皮肤并用青霉素局部消毒,其余步骤同手术各组大鼠。

1.3.3 分组及处理：将手术大鼠随机分为川芎嗪组、西药组和模型组，每组20只，未经干预小鼠作为正常组。即共分为5组，对照组、假手术组、模型组、西药组和川芎嗪组，每组各20只。造模当天开始，正常组、模型组与假手术组1次/天静脉注射无菌生理盐水10 mL，川芎嗪组静脉注射川芎嗪注射液10 mL /(kg·d)，西药组静脉注射阿托伐他汀注射液10 mL /(kg·d)，在实验第10天时处死一半大鼠检测相关指标，第20天时，处死余下各组大鼠检测相关指标。

1.4 检测指标及观察方法 分别于干预10 d和20 d时取各组大鼠血浆3 mL，2 mL加入抗氧化剂(Ox-LDL测定)和抗凝剂，余下用于检测硫化氢和血浆胆红素。

1.4.1 硫化氢含量的检测：分别于干预10 d和20 d时取各组大鼠0.1 mL血浆标本混匀，加入0.5 mL 1%醋酸锌，0.5 mL 20 mmol/L对苯二胺盐酸盐以及0.5 mL 30 mmol/L三氯化铁，离心取上清液，采用亚甲蓝分光光度法(在波长652 nm下进行检测)。检测上清液的吸光度(A)值。根据标准曲线计算上清液中H2S含量。

1.4.2 血浆胆红素含量的检测：分别于干预10 d和20 d时取各组大鼠血浆用钒酸盐氧化法测定血浆总胆红素。第一试剂14 μm与标本10 μL，读取1次吸光度，加第二试剂35 μL，第2次读取吸光度，前后2次吸光度之差与标准吸光度之差比较，即胆红素量。

1.4.3 氧化低密度脂蛋白含量的检测：分别于干预10 d和20 d时取各组大鼠血浆2 mL应用酶联免疫吸附(ELISA)双抗体夹心法，测定待测样品中的Ox-LDL含量。

1.4.4 脑组织病理学检测：分别于干预10 d和20 d时用20%乌拉坦腹腔注射麻醉，采用颈椎脱臼法处死后各组大鼠，立即断头取脑，固定48 h后，进行常规的石蜡包埋，切片，染色。

2 结果

2.1 模型验证

2.1.1 Bederson评分法 参照Bederson评分法[7]，0分：无神经功能缺失症在大鼠麻醉苏醒后6 h内评定。1分：提起鼠尾离地面约33 cm时对侧前肢屈曲；2分：观察前肢的肌张力，前肢屈曲及对侧躯体抵抗力下降；3分：将大鼠置于平滑地板上，推动阻力下降，行走时向对侧转圈；4分：眼分泌物增多，向对侧转圈及意识障碍。1分以上者即为造模成功。见表1。

表1 各组神经功能缺失评分表±s，分)Tab.

2.1.2 MR扫描方法：MR扫描方法采用MR成像系统对造模6 h后所有大鼠模型行MR扫描，模型组大脑出现高信号，表示造模成功。见图1。

图1 急性脑梗死大鼠MR扫描图Fig.1 MR of acute cerebral infarction rats

2.2 硫化氢(H2S)水平比较 与对照组及假手术组相比，川芎嗪组和西药组H2S水平均有明显上升，差异具有统计学意义(P<0.05)；治疗20 d后，与西药组相比，川芎嗪组H2S水平上升更为显著(P<0.05)。见表2。

表2 治疗前后各组H2S水平Tab.

*P<0.05，compare with control group，△P<0.05，compare with western medicine group

2.3 血浆胆红素水平比较 与对照组及假手术组相比，川芎嗪组和西药组血浆胆红素水平均有明显上升，差异具有统计学意义(P<0.05)；治疗20 d后，与西药组相比，川芎嗪组血浆胆红素水平上升更为显著(P<0.05)。见表3。

表3 治疗前后各组血浆胆红素水平Tab.3 Plasma bilirubin level of all group before and after ±s，μmol/L)

*P<0.05，compare with control group，△P<0.05，compare with western medicine group

2.4 氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)水平比较 与对照组及假手术组相比，川芎嗪组和西药组Ox-LDL水平均有明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；治疗20天后，与西药组相比，川芎嗪组Ox-LDL水平下降更为显著(P<0.05)。见表4。

表4 治疗前后各组ox-LDL水平比较Tab.4 Comparison of ox-LDL of all group before and after ±s，μmol/L)

*P<0.05，compare with control group；△P<0.05，compare with western medicine group

2.5 脑组织病理学改变 各组大鼠脑组织病理学切片显示：川芎嗪组：少数神经细胞死亡，细胞质疏松及肿胀明显减轻；西药组：细胞核少见固缩，脑组织水肿有减轻；模型组大鼠：脑组织周围神经元肿胀并出现皱缩，细胞核固缩，梗死灶内细胞和血管坏死，正常组织消失，结构模糊、间质水肿；对照组及假手术组大鼠：细胞形态正常，分布均勾，未见皮质部苍白梗死，见图2。

图2 各组大鼠脑组织病理学切片Fig.2 Brain tissue pathological slices of rat

3 讨论

有研究表明，急性脑梗死发生动脉粥样硬化的关系密切，而血浆水平的脂质水平升高能够促使动脉粥样硬化形成[8]。硫化氢(hydrogensulfide，H2S)是一种具有臭鸡蛋气味的毒性气体，以前的研究多集中于其毒性作用[9]。20世纪90年代，人们发现机体还可以内源性产生含量相当高的H2S，内源性，具有舒张血管平滑肌、降低血压、抑制血管平滑肌细胞增殖及抗氧化应激等多种效应[10]。通过调节KAPT通道直接舒张血管平滑肌使脑血管舒张，改善脑血流量。抑制平滑肌的增殖和促进细胞的凋亡，抑制血管的重塑。这些均表明H2S在缺血性脑血管疾病的发病过程中可能起着重要的保护作用[11]。胆红素主要来源于血红蛋白的分解代谢，在体内具有抗氧化性，减少氧化低密度脂蛋白的生成。研究资料显示，急性脑梗死患者血中胆红素显著降低，这可能由于急性脑梗死患者血中胆红素下降，使体内自由基清除能力下降，导致体内脂类过氧化反应促进动脉粥样硬化[12]。有有研究表明其与低密度脂蛋白(LDL)有密切关系[13]。LDL促进动脉粥样硬化的发生发展主要通过Ox-LDL的作用得以实现。低密度脂蛋白被氧化后形成了氧化低密度脂蛋白而氧化低密度脂蛋白又有新的生物活性，加速脂质沉积，从而促使动脉粥样硬化形成以及促使血栓形成，并且Ox-LDL能够引起血管内皮细胞功能障碍和内皮细胞损伤，这一作用是启动动脉粥样硬化发生的重要环节[14]。Ox-LDL诱导内皮细胞凋亡是动脉粥样硬化发生的始动环节[15]。形成从而引起急性脑梗死发生。川芎是一种常用中药，随着人们对其研究的深入，川芎嗪在预防和治疗多种疾病方面的药理作用及临床应用非常广泛，但对于川芎嗪对急性脑梗死的研究尚少为了探索这个问题，改善其预后，进行了本研究。

研究结果显示，与对照组及假手术组相比，川芎嗪组和西药组H2S及血浆胆红素水平均有明显上升，差异具有统计学意义(P<0.05)；治疗20 d后，与西药组相比，川芎嗪组H2S及血浆胆红素水平上升更为显著(P<0.05)。证明川芎嗪能够升高H2S及血浆胆红素水平，抑制动脉硬化的形成。与对照组及假手术组相比，川芎嗪组和西药组Ox-LDL水平均有明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；治疗20 d后，与西药组相比，川芎嗪组Ox-LDL水平下降更为显著(P<0.05)。证明川芎嗪能够降低脂蛋白水平，治疗急性脑梗死。各组大鼠脑组织病理学切片显示：川芎嗪组：少数神经细胞死亡，细胞质疏松及肿胀明显减轻；西药组:细胞核少见固缩，脑组织水肿有减轻；模型组大鼠：脑组织周围神经元肿胀并出现皱缩，细胞核固缩，梗死灶内细胞和血管坏死，正常组织消失，结构模糊、间质水肿；对照组及假手术组大鼠：细胞形态正常，分布均匀，未见皮质部苍白梗死。

综上所述，川芎嗪能够升高急性脑梗死模型大鼠硫化氢、血浆胆红素水平，升高氧化低密度脂蛋白水平，对临床具有指导意义。

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(编校：谭玲)

Significance of Ligustrazine on acute cerebral infarction rat model and its changes on hydrogen sulfide, plasma bilirubin and oxidized low density lipoprotein level

ZHANG Guo-zhen1,ZHENG Wei-hong2Δ,LIANG RONG1

(1. Cadres of Health, Inner Mongolia Autonomous Region People’s Hospital, Hohhot 010017, China; 2. Department of Neural Internal Medicine, Zhongshan Hospital Affiliated to Xiamen University, Xiamen 361004, China)

ObjectiveTo explore significance of Ligustrazine on acute cerebral infarction rat model and its effects on hydrogen sulfide, plasma bilirubin and oxidized low density lipoprotein level.Methods100 healthy SD rats, (250±30) g, male or female, were divided into five groups (control group, sham operation group, model group, western medicine group, and Ligustrazine group)，each had 20. Experimental groups prepared focal cerebral ischemia model with suture method. Normal group, model group and the sham group once daily intravenous injected sterile saline 10 mL, Ligustrazine intravenous injection group injected Ligustrazine 10 mL/(kg·d), the WM group intravenous injected atorvastatin 10 mL/(kg·d). Half of the rats were sacrificed at 10 days of the experiment to detect the relevant indicators, at 20 days, the remaining rats in each group were sacrificed. Blood hydrogen sulfide, plasma bilirubin and oxidized LDL levels were detected, and brain pathology change were observed.ResultsCompared with control group and sham group, in Ligustrazine group and western medicine group,hydrogen sulfide and plasma bilirubin levels increased significantly, and the difference was statistically significant (P<0.05); after 20 days of treatment, compared with western medicine group Ligustrazine group hydrogen sulfide and plasma bilirubin levels rose more significant (P<0.05). Compared with control group and sham group, in Ligustrazine group and western medicine group, OxLDL levels decreased significantly, the difference was statistically significant (P<0.05); after 20 days of treatment, compared with western medicine group, OxLDL levels in Ligustrazine group decreased more significant (P<0.05). The rats brain histopathology examination showed that, Ligustrazine group: few nerve cell death, cytoplasm loose and swelling reduced significantly; WM group: condensation nuclei rare, brain edema relieve; model rats: brain tissue surrounding the nerve yuan swelling and the emergence of shrinkage, nuclear condensation within the infarct cells and vascular necrosis of normal tissue disappeared, fuzzy structure, interstitial edema; the control group and the sham-operated rats: normal cell morphology, distribution, no cortical Ministry pale infarction.ConclusionLigustrazine can increase acute hydrogen sulfide, plasma bilirubin levels in rats with cerebral infarction, elevate level of oxidized low-density lipoprotein, has clinical significance.

Ligustrazine; acute cerebral infarction; hydrogen sulfide; plasma bilirubin; oxidized low-density lipoprotein

张国珍，女，硕士，住院医师，研究方向：心血管内科疾病诊断与治疗，E-mail：zgzing2@163.com；郑维红，通讯作者，女，本科，主任医师，研究方向：癫痫与脑血管病，E-mail：zwh610547@xmu.edu.cn。

R743

A

1005-1678(2015)03-0028-04