冠心十味丸对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤后的保护作用

刘丽娟,范蕾,常福厚,白图雅,吕小丽,李凌

(内蒙古医科大学 药学院，内蒙古 呼和浩特 010110)



冠心十味丸对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤后的保护作用

刘丽娟,范蕾Δ,常福厚,白图雅,吕小丽,李凌

(内蒙古医科大学 药学院，内蒙古 呼和浩特 010110)

目的 研究冠心十味丸对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的保护作用。方法 50只Wistar大鼠随机分成正常组、模型组、冠心十味丸低、高剂量组(0.3、0.9 mg/kg)、阳性对照组(复方丹参滴丸处理液)，每组各10只。构建离体大鼠心脏再灌注实验模型，测定给药后70 min各组大鼠心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)、Ca2+-ATP酶、Ca2+- Mg2+-ATP酶、Na+- K+-ATP酶的含量。结果 与模型组相比，冠心十味丸可明显升高心肌缺血再灌注损伤时SOD、Ca2+-ATP酶、Ca2+- Mg2+-ATP酶、Na+- K+-ATP酶活性(P<0.05或P<0.01)，降低缺血再灌注损伤时LDH、CK活性,减少MDA含量(P<0.05 或P<0.01)。结论 冠心十味丸对离体大鼠心肌缺血；再灌注损伤具有保护作用。

冠心十味丸；心肌缺血再灌注损伤；心肌酶

冠心十味丸是由内蒙古医科大学自主开发的新药，该药由蒙医古方而来，由十味中蒙药材组成，按照君、臣、佐、使，科学组方设计而成，主要具有调心“赫依”、血相搏、活血、安心、化脂等功效，用于心烦、心区刺痛，心供血不足等。对于现代医学可用来治疗冠心病、高血脂、高血压等疾病。本研究根据其功能主治，研究冠心十味丸对心肌缺血和心肌梗塞的保护作用，为其临床应用提供药效学依据。本实验拟采用离体大鼠心脏全心缺血再灌流法[1-2]，研究冠心十味丸对离体心脏全心缺血再灌注损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：雄性Wistar大鼠，180～220 g， 共50只。 清洁二级，来自内蒙古大学动物室，合格证号 (京动字) 第 8806R011 号。

1.1.2 药品与试剂：冠心十味丸(内蒙古医科大学药学院自制，批号：130207048)，氯化钠注射液(河北天成药业股份有限公司，批号：12122510)，25%乌拉坦(北京化工厂，批号：120125)，SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所，生产批号：20130218)，LDH(南京建成生物工程研究所，生产批号：20130420)，CK(南京建成生物工程研究所，生产批号：20130211)，MDA(南京建成生物工程研究所，生产批号：20130303)，Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+- K+-ATP酶试剂盒(南京建成生物工程研究所，生产批号：20130328，规格：100 T/96样)，复方丹参滴丸(天津天士力制药股份有限公司，生产批号：120710)。

1.1.3 仪器：GL-2离体心脏灌流系统、YY-2药液泵、HW-1000超级恒温水浴(成都泰盟科技有限公司)，TG-16微量高速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，旋片式真空泵(浙江飞跃机电有限公司)，TUBE MIXER TRIO数显恒温三用水箱(上海梅香仪器有限公司)，TG16-微量高速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，YU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组和给药：50只大鼠随机分成正常组、模型组、低剂量组、高剂量组、阳性对照组，各10只。正常组：平衡灌流70 min；模型组：平衡20 min，灌流10 min，停灌20 min，再灌20 min；冠心十味丸低剂量组和高剂量组：平衡20 min，含药灌10 min，停灌20 min，再含药灌20 min(低剂量给药量：0.3 mg/kg，高剂量给药量：0.9 mg/kg)；阳性对照组：平衡20 min，含复方丹参滴丸处理液灌流10 min，停灌20 min，再含药灌20 min(给药量：0.05 mg/kg)。

1.2.2 大鼠离体心脏全心缺血—再灌注(I/R)模型制备：术前皮下注射25%的乌拉坦0.4～0.6 mL/100g,麻醉后快速开胸，剪破心包膜，剪断上下腔静脉、肺动脉、主动脉(保留1 cm左右)及心脏周围组织，取心脏置于冰的Kreb’s-Henseleit溶液中清洗除去污血，剔除血管、脂肪等非心肌组织，挂于GL-2离体心脏系统上进行灌流，灌流液采用氧饱和的37 ℃ K-H溶液。灌流结束后，用吸水纸吸取心脏水分，取左心室称重，冻存于-80 ℃冰箱中。

1.2.3 组织匀浆制备与测定：从-80 ℃冰箱中取出左心室，解冻，用十字匀浆器冰水浴研磨，按心脏组织g重/生理盐水mL数1:9将组织液制备成10%匀浆，然后低温超速离心3500 r/min 离心10 min,取上清液，再用生理盐水稀释成1%的匀浆，严格按试剂盒说明书操作，考马斯亮蓝法测定心肌组织蛋白含量，测定心肌匀浆SOD、CK、LDH、MDA、Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶；1%心肌组织匀浆的蛋白浓度为0.525 mg·prot/mL。

2 结果

2.1 冠心十味丸对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤后SOD的影响 与正常组相比，模型组SOD酶活性显著降低(P<0.05)；与模型组相比,冠心十味丸组(0.9 mg/kg，0.3 mg/kg)再灌注损伤后SOD值明显升高(P<0.01)，即冠心十味丸可以升高心肌缺血再灌注损伤时SOD酶活性。见表1。

表1 冠心十味丸对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤后SOD的影响±s)Fig.1 Effect of GuanXinShiWeiWan on SOD activity of ischemia reperfusion(I-R) injury ±s)

△P<0.05，与正常组比较，compared with normal group；**P<0.01，与模型组比较，compared with model group

2.2 冠心十味丸对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤后LDH的影响 与正常组相比，模型组LDH含量显著升高(P<0.05)；与模型组相比, 冠心十味丸组(0.9 mg/kg,0.3 mg/kg)再灌注损伤后LDH值明显降低(P<0.05)，即冠心十味丸可以降低心肌缺血再灌注损伤后LDH活性。见表2。

表2 冠心十味丸对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤后LDH的影响±s)Fig.2 Effect of GuanXinShiWeiWan on LDH activity of ischemia reperfusion(I-R) injury ±s)

△P<0.05，与正常组比较，compared with normal group；**P<0.01，与模型组对比较，compared with model group

2.3 冠心十味丸对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤后MDA的影响 与正常组相比，模型组MDA含量显著升高(P<0.05)；与模型组相比, 冠心十味丸组(0.9 mg/kg，0.3 mg/kg)再灌注损伤后MDA值明显降低(P<0.01), 即冠心十味丸胶囊可以减少心肌缺血再灌注损伤后MDA含量。见表3。

表3 冠心十味丸对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤后MDA的影响±s)Fig.3 Effect of GuanXinShiWeiWan on MDA content of ischemia reperfusion(I-R) injury ±s)

△P<0.05，与正常组比较，compared with normal group；**P<0.01，与模型组比较，compared with model group

2.4 冠心十味丸对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤后CK的影响 与正常组相比，模型组CK活性显著升高(P<0.01)；与模型组相比, 冠心十味丸组(0.9 mg/kg，0.3 mg/kg)再灌注损伤后CK值明显降低(P<0.01)，即冠心十味丸胶囊可以降低心肌缺血再灌注损伤后CK活性。见表4。

表4 冠心十味丸对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤后CK的影响±s)Fig.4 Effect of GuanXinShiWeiWan on CK activity of ischemia reperfusion(I-R) injury ±s)

△△P<0.01，与正常组比较，compared with normal group；**P<0.01，与模型组比较，compared with model group

2.5 冠心十味丸对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤后Ca2+-ATP酶活力的影响 与正常组相比，模型组Ca2+-ATP酶活性显著升高(P<0.05)；与模型组相比, 冠心十味丸组(0.9 mg/kg，0.3 mg/kg)再灌注损伤后Ca2+-ATP酶值明显升高(P<0.01)，即冠心十味丸胶囊可以升高心肌缺血再灌注损伤后Ca2+-ATP酶活性。见表5。

表5 冠心十味丸对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤后Ca2+-ATP酶 活力的影响±s)Fig.5 Effect of GuanXinShiWeiWan on Ca2+-ATP activity of ischemia reperfusion(I-R) injury ±s)

△P<0.05，与正常组比较，compared with normal group；**P<0.01，与模型组比较，compared with model group

2.6 冠心十味丸对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤后Ca2+- Mg2+-ATP酶活力的影响 与正常组相比，模型组Ca2+- Mg2+-ATP酶活性显著升高(P<0.01)；与模型组相比,冠心十味丸组(0.9 mg/kg，0.3 mg/kg)再灌注损伤后Ca2+-Mg2+-ATP酶值明显升高(P<0.01)，即冠心十味丸胶囊可以升高心肌缺血再灌注损伤后Ca2+- Mg2+-ATP酶活性。见表6。

表6 冠心十味丸对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤后Ca2+- Mg2+-ATP酶 活力的影响±s)Fig.6 Effect of GuanXinShiWeiWan on Ca2+-Mg2+-ATP activity of ischemia reperfusion(I-R) injury ±s)

△△P<0.01，与正常组比较，compared with normal group；**P<0.01，与模型组比较，compared with model group

2.7 冠心十味丸对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤后Na+- K+-ATP酶活力的影响 与正常组相比，模型组Na+- K+-ATP酶活力显著升高(P<0.05)；与模型组相比，冠心十味丸组(0.9 mg/kg，0.3 mg/kg)再灌注损伤后Na+- K+-ATP酶值明显升高(P<0.01)，即冠心十味丸可以升高心肌缺血再灌注损伤后Na+-K+-ATP酶活性。见表7。

表7 冠心十味丸对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤后Na+- K+-ATP酶 活力的影响±s)Fig.7 Effect of GuanXinShiWeiWan on Na+- K+-ATP activity of ischemia reperfusion(I-R) injury ±s)

△P<0.05，与正常组比较，compared with normal group；**P<0.01，与模型组比较，compared with model group

3 讨论

目前认为,心肌缺血再灌注损伤的机制与心肌能量代谢障碍、氧自由基大量产生、细胞内钙离子超载、血管内皮细胞分泌一系列内皮因子等因素有关[3-5]。实验中，模型组离体大鼠心肌缺血再灌注损伤后，心肌组织SOD、Ca2+-ATP酶、Ca2+- Mg2+-ATP酶、Na+- K+-ATP酶活性下降，CK、LDH活性升高，MDA含量升高。当组织细胞缺血、缺氧时，氧自由基清除系统功能降低或丧失，而生成系统却活性增强，一旦恢复组织血液供应和氧供，氧自由基便大量产生与急剧堆积，以不同方式造成细胞急性或慢性损伤, SOD可清除氧自由基，使细胞免受氧自由基的毒性损伤[6]；丙二醛(MDA)是过氧化脂质的一种重要分解产物，常被用作为脂质过氧化程度的检测指标，它可间接反映体内的氧化应激水平。而SOD作为内源性的自由基清除剂，对过氧化脂质的形成有阻止作用。缺血再灌注后产生的大量氧自由基及通过与不饱和脂肪酸作用引发脂质过氧化反应生成的MDA，可通过多种途径造成细胞膜及亚细胞器膜结构破坏，导致再灌注损伤[7-9]。SOD是内源性氧自由基清除剂，而MDA是脂质过氧化反应的终产物，2者是能反映氧自由基的产生及引发脂质过氧化反应程度的指标[10]。细胞内钙离子(Ca2+)浓度的改变是造成MIRI的重要原因之一。当心肌细胞缺血缺氧时，线粒体功能障碍导致ATP生成减少，再灌注后，细胞内Ca2+增加，刺激线粒体钙泵摄Ca2+，Ca2+与线粒体内含磷酸根的化合物结合，形成沉淀，干扰线粒体的氧化磷酸化：Ca2+浓度升高可激活多种磷脂酶，促进膜磷脂分解，造成生物膜的损伤：由于Na+/Ca2+交换增加，形成一过性内向性离子流，在心肌动作电位后形成迟后除极而引起心律失常；缺血再灌注后，细胞重新获得能量，在胞浆中高浓度Ca2+的条件下，肌原纤维过度收缩，导致细胞凋亡 。由此可见，降低细胞内Ca2+超载是再灌注损伤时心肌保护的关键环节[11]。

本实验表明，冠心十味丸使SOD、Ca2+-ATP酶、Ca2+- Mg2+-ATP酶、Na+- K+-ATP酶的含量不同程度升高，可抑制乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)的活性，并一定程度上减少了丙二醛(MDA)的生成，提示冠心十味丸可通过提高氧自由基清除剂的活力、增强心肌抗氧化能力、抑制心肌脂质过氧化、减轻心肌缺血再灌注损伤时钙超载而保护心肌达到预防MIRI的目的，并改善心肌缺血再灌注损伤后心脏功能。

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(编校：吴茜)

Protective effect of GuanXinShiWeiWan on isolated rat hearts with ischemia reperfusion injury

LIU Li-juan,FAN LeiΔ,CHANG Fu-hou,BAI Tu-ya,LV Xiao-li,LI Lin

(College of Phamacy, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of GuanXinShiWeiWan on ischemia reperfusion(I-R) injury rat.Methods50 Wistar rats were randomly divided into normal group, model group, GuanXinShiWeiWan low (0.3 mg/kg)and high(0.9 mg/kg) dose group and positive group, each had 10 rats.Adopting the model of ischemia reperfusion injury of isolated rat hearts, the contents of SOD，MDA，LDH，CK and Ca2+-ATP，Ca2+- Mg2+-ATP，Na+- K+-ATP in cardiac muscle tissue were tested and compared.ResultsCompared with model group, GuanXinShiWeiWan significantly improved the activities of SOD、Ca2+-ATP，Ca2+- Mg2+-ATP and Na+- K+-ATP (P<0.05 orP<0.01) in cardiac muscle tissue which injured by ischemia reperfusion, while reducing markedly the contents of MDA，LDH，CK(P<0.05 orP<0.01).ConclusionGuanXinShiWeiWan can profect the cardiac muscle of ischemia reperfusion.

GuanXinShiWeiWan;myocardial ischemia reperfusion injury;cardiac enzyme

刘丽娟，女，硕士在读，研究方向：微生物与生化药学，E-mail：994097848@qq.com；范蕾，通讯作者，女，副教授，硕士，研究方向：中蒙药药理学研究，E-mail：826368267@qq.com。

R961.1

A

1005-1678(2015)03-0021-04