甜瓜种子中种传病毒的RT—PCR检测

彭斌 汪丽刚 古勤生

摘 要： 为了建立葫芦科作物干种子主要种传病毒检测方法，在现有的TRIZOL法、CTAB法等提取植物总RNA方法的基础上进行改良，从富含有多糖的甜瓜干种子中提取高质量的总RNA。建立了18 S rRNA为内参基因的侵染葫芦科作物4种主要种传病毒的两重RT-PCR检测方法。应用改良TRIZOL法分别提取单粒和0.1 g（约20粒）带毒甜瓜种子的总RNA作为检测模板，分别对4种种传病毒进行RT-PCR检测，结果表明可分别从携带4种种传病毒的甜瓜种子上检测到对应的病毒，18 S rRNA基因能够很好的作为内参基因对病毒检测结果进行评估。

关键词： 葫芦科作物； 干种子； 多糖； 种传病毒； 反转录聚合酶链式反应

Abstract： In order to establish a method of detection of the major seed-transmitted virus in dry cucurbit seeds，we modified the total RNA extract methods based on TRIZOL and CTAB，and then the high quality of total RNA was obtained from dry melon seeds rich in polysaccharide. A duplex RT-PCR method was developed for four kinds of seed-transmitted viruses infecting cucurbits respectively，including an internal amplification control 18 S rRNA gene of host. The total RNA extracted from single and mixture（about 20 seeds） infected melon seeds by modified TRIZOL method were used as templates of dulplex RT-PCR detection for the four kinds of viruses respectively. The results indicated that RT-PCR detection system was capable of detecting four different viruses pathogens in samples，and the 18 S rRNA gene as internal control was a useful indicator of the quality of plant total RNA extraction effect and the effectiveness of RT-PCR.

Key words： Cucurbitaceae； Dry seeds； Polysaccharide； Seed-transmitted virus； RT-PCR assay

葫芦科（Cucurbitaceae）植物如黄瓜（Cucumis sativus L.）、西瓜（Citrullus lanatus）、甜瓜（Cucumis melo）、南瓜（Cucurbita moschata），是一年生或多年生攀缘性植物，作为重要的经济作物在热带、亚热带以及温带地区世界范围内大量种植。据FAO组织2013年统计数据，中国的黄瓜、西瓜和甜瓜占全世界种植面积和总产量均一半以上，居世界首位。随着国际贸易的日益增长，种质资源引进的批次数量也逐渐增加，病毒随种子传入的可能性很高，一方面影响当年种质作物的品质和产量，并可能影响后代的产量和品质，另一方面还有可能引入新的危险性种传植物病毒[1]。目前在葫芦科作物上的已证实可通过种子传播的病毒有11种，其中种子传播造成严重危害的病毒有4种，分别是黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle virus，CGMMV）、甜瓜坏死斑点病毒（Melon necrotic spot virus，MNSV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和南瓜花叶病毒（Squash mosaic virus，SqMV）[2- 3]。

携带种传病毒的种子可以成为病毒病害发生的早期侵染源。当存在有效昆虫载体或机械接触的情况下可使病毒在生长的植物中大面积传播，阻断种传病毒的传播可能具有非常重要的经济意义[4]。防控种传病毒传播最有效办法是阻止带毒种子进入生产，所以亟需一套快速、简便、灵敏的种传病毒检测方法。目前种传病毒的检测有生物学测定、免疫血清学法以及分子生物学方法。生物学测定需要制备接种物，在防虫温室中接种指示植物至少观察2周以上，费时费力，且需要比较好的基础设施。免疫血清学适合大量样本的检测，但是高灵敏、高特异性的抗体获得不易，且易出现假阳性或假阴性[5]。种传病毒的分子生物学检测方法主要是RT-PCR，該方法灵敏度高，但是如何提取高质量的RNA是影响从种子上检测种传病毒效果的关键步骤。因为葫芦科种子中含有大量多糖、蛋白质以及次生代谢物质，严重干扰了RNA的提取并抑制后续检测中酶的活性[6]。

实验室目前提取植物总RNA最常用的是Chomczynski[7]等提出的异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法，另外氯化锂法、CTAB法、SDS法以及吸附柱法等在植物上使用也较多，但是以上方法单独提取植物种子总RNA的得率或纯度都不太理想[8-10]。胡群文等[8]利用SDS法和异硫氰酸胍法相结合从水稻、大豆、花生等作物的干种子中提取RNA；任增凯等[9]利用改良的CTAB法从花生种子、根茎等组织提取RNA；孙海波等[10]采用改良的吸附柱法从油菜、花生、芝麻和大豆等作物的种子提取总RNA，应用于RT-PCR或RT-qPCR均取得较好的结果。

本研究对目前实验室常用提取植物总RNA的方法进行改良，希望建立一套适用于葫芦科种子的快速、简便的总RNA提取方法。并应用该方法提取的总RNA作为检测模板，用于建立有内参控制的葫芦科作物的主要种传病毒的RT-PCR检测方法。

1 材料和方法

1.1 材料

CGMMV、SqMV 、CMV、和MNSV 4种毒源由本实验室分离、鉴定和保存。带毒种子获得：甜瓜种子（品种：‘落花甜）播种于温室中，使其在夏季成熟。在2～3片真叶时单株摩擦接种病毒，CMV、SqMV与CGMMV接种于‘落花甜。2周以后，转移入大花盆中，置于防虫玻璃温室中培养并进行人工授粉，并定期施肥和打药。种子成熟后，获得种子，置于4 ℃保存。MNSV来自江苏海门经ELISA检测阳性的感病甜瓜植株（‘海蜜1号）收获的种子。

1.2 试剂与溶液配制

TRIzol Reagent购自Invitrogen；RNAiso plus购自TaKaRa生物公司。氯仿、异戊醇等其他试剂均为国产分析纯试剂。高盐溶液（0.8 mol·L-1柠檬酸钠+1.2 mol·L-1氯化钠），5 mol·L-1氯化钠及5 mol·L-1醋酸钾，均用0.1%（φ）DEPC处理后高压灭菌；75%（φ，后同）乙醇（DEPC处理水配制）；CTAB提取液：2%（ω，后同）CTAB，2%（ω）NaCl，50 mmol·L-1 Tris-HCl（pH 8.0），25 mmol·L-1 EDTA（pH 8.0），2%（φ）β-巯基乙醇；异硫氰酸胍溶液：4 mol·L-1异硫氰酸胍（GIT），25 mmol·L-1柠檬酸钠（pH 7.0），0.5%（ω）十二烷基肌氨酸钠（Sarcosyl），0.1 mol·L-1 β-巰基乙醇（用时再加每50 mL体系加0.36 mL）。研钵和玻璃器皿锡纸包裹，160 ℃烘烤4 h以上。不能用DEPC处理的溶液配制塑料制品。电泳槽、梳子用0.5 mol·L-1 NaOH浸泡30 min以上，自来水淋洗干净。配制的溶液应尽可能用0.1%（φ）DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经直径0.22 μm滤膜过滤除菌。

1.3 总RNA提取与检测

1.3.1 改良TRIZOL法 称取大约0.1 g甜瓜种子置于用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨成粉末状。向研钵中加入1 mL TRIzol Reagent或者RNAiso Plus提取液，将粉末状的样品完全覆盖，继续研磨至裂解液呈透明状。将裂解液转移至1.5 mL离心管中，12 000 r·min-1 4 ℃离心5 min，取上清液加入 1/5 体积的 5 mol·L-1NaCl 和 3/5 体积的氯仿，用力振荡，待溶液充分乳化后，再室温静置 5 min，12 000 r·min-1 4 ℃离心15 min，吸取上清液转移至另一新的离心管中。如果要得到高纯度RNA，可用水饱和酚、氯仿体积比为1∶1再抽提一次，最后向上清液中加入 1/2 体积的异丙醇和 1/2 体积的高盐溶液，上下颠倒离心管充分混匀后，在室温静置10 min，12 000 r·min-1 4 ℃离心 10 min。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。小心弃去上清液，加入 75%的乙醇 l mL洗涤离心管管壁，12 000 r·min-1 4 ℃离心2 min后，小心弃去乙醇（为了更好地控制 RNA 中的盐离子含量，应尽量除净乙醇）。室温干燥沉淀 2～5 min，加入适量的 RNase-free水溶解沉淀，待 RNA 沉淀完全溶解后于-80 ℃保存。单粒种子按上述比例加入适当TRIzol裂解液液进行总RNA提取。

1.3.2 CTAB-TRIZOL法 称取大约0.1 g甜瓜干种子，在液氮预冷的研钵中，用研杵研磨成粉末状。迅速转移至含有0.6 mL CTAB提取缓冲液[（100 mmol·L-1 Tris，50 mmol·L-1 EDTA，pH 8.0，2 mol·L-1NaCl and 2% CTAB）；临用前加入1%（φ）β-Mercaptoethanol]的离心管中，充分震荡混匀后，室温放置15 min。然后缓慢加入1/15体积无水乙醇和1/15体积5 mol·L-1 醋酸钾（pH 4.8），轻轻混匀。加入0.6 mL氯仿、异戊醇体积比24∶1的溶液，充分震荡混匀，在4 ℃ 13 000 r·min-1离心20 min。上清液转移到一个新的离心管中，加入等体积的TRIzol，充分震荡混匀后，室温放置5 min，加入1/5 TRIzol体积的氯仿，充分震荡混匀，13 000 r·min-1离心10 min。取上清液，如果要得到高质量的总RNA，上清液等体积的氯仿再抽一次，如果用于病毒检测，则可以省略这一步。上清液中加入等体积的异丙醇，室温放置10 min，4 ℃ 13 000 r·min-1离心10 min。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。小心弃去上清液，加入 75%的乙醇 l mL洗涤离心管管壁，12 000 r·min-1 4 ℃离心 2 min后，小心弃去乙醇。室温干燥沉淀 2～5 min，加入适量的RNase-free水溶解沉淀，待RNA 沉淀完全溶解后于-80 ℃保存。

1.3.3 CTAB-异硫氰酸胍法 前述步骤相同，第一次离心后上清液中加入等体积的异硫氰酸胍提取液；1/10体积2 mol·L-1 醋酸钾；1 体积水饱和酚；1/5体积氯仿∶异戊醇（体积比为24∶1），溶液充分震荡混匀，冰上放置15 min，13 000 r·min-1 4 ℃离心20 min，转移上清至一新的离心管中，加入上清液等体积的氯仿再抽提一次，13 000 r·min-1 4 ℃离心5 min。上清液中加入等体积的异丙醇，室温放置10 min，4 °C 13 000 r·min-1离心15 min。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。为了得到最大量RNA，可以置于-20 ℃过夜沉淀。

1.3.4 总RNA质量检测 NaOH浸泡过的电泳槽用流水冲洗干净。30 mL的1.2%（ω）的琼脂糖凝胶加入0.8 mL的37%（φ）甲醛然后加入EB制成甲醛变性琼脂糖凝胶。变性凝胶先预电泳10 min后取4 μL RNA样品与1 μL 6×loading buffer混匀，直接上样，7.5 V·cm-1电压下电泳。电泳结束后，凝胶成像系统观察。

1.4 引物设计与RT-PCR反应体系

18 S rRNA和CMV引物根据赵丽等[11]和CGMMV引物根据黄静等[12]报道合成；根据GenBank上登录的MNSV和SqMV已知各病毒序列核苷酸序列，DNAMAN Version5.2.2比較了它们之间的保守序列区，并设计了特异性引物。以上引物均由北京三博远志生物技术有限公司合成（表1）。

将反转录产物作为PCR 反应的模板，按次序在0.2 mL无菌离心管中加入以下成分：10×PCR buffer 2.0 μL，dNTPs（2.5 mmol·L-1 each）2.0 μL，病毒和内参的特异正反向引物（10 μmol·L-1）各1.0 μL，RT产物2 μL，Taq DNA聚合酶（5 U·μL-1）0.2 μL，最后用ddH2O补足到20 μL。混匀后短暂离心，放入PCR仪的样品孔上反应，退火温度为54 ℃。在1.2%（ω）的琼脂糖凝胶上（含0.5 μg·L -1 EB）电泳检测。

1.5 种子带毒检测应用

本试验采用改良TRIZOL法分别对单粒和0.1 g（约20粒）可能携带种传病毒的甜瓜种子提取总RNA作为RT-PCT检测模板，每种病毒单粒种子不少于10粒重复，0.1 g种子不少于5次重复。应用上述RT-PCR程序和反应体系进行检测。

2 结果与分析

2.1 不同方法对甜瓜干种子RNA提取质量的影响

如图1所示：改良TRIZOL法（采用TRIzol Reagent和RNAISO Plus 2种试剂）与CTAB-TRIZOL法和CTAB-异硫氰酸胍法均能提取甜瓜干种子组织总RNA，电泳条带清晰，可见28 S rRNA，18 S rRNA，而且无拖尾现象，表明提取的RNA完整。整体上看，均无明显的DNA和蛋白质污染。其中2种不同TRIzol试剂改良方法提取的总RNA质量也无明显区别，1 h可完成。CTAB-TRIZOL法 和CTAB-异硫氰酸胍法存在DNA污染，但可经过DNase酶去除，所需时间需要1.5 h，比改良TRIZOL法耗时稍长。应用建立的方法提取甜瓜干种子总RNA，对提取的RNA通过RT-PCR扩增18 S rRNA，结果（图2）表明：3种方法提取的总RNA经过RT-PCR扩增均可获得单一的目的特异性条带。

2.2 感染4种病毒的叶片的RT-PCR检测

为验证本试验设计的4种病毒的检测引物和RT-PCR反应体系效果，我们利用常规TRIZOL方法提取分别感染4种病毒的叶片和健康甜瓜叶片的RNA，分别对4种病毒及18 S rRNA进行RT-PCR检测。检测结果分别得到650、580、394、294、120 bp 5个片段（图3），与引物设计的目的条带完全符合。从整体上看4种病毒和植物内参18 S rRNA的扩增主条带清晰明显，且均无非特异性的条带扩增。符合RT-PCR检测病毒的要求。

2.3 分别携带4种病毒种子的RT-PCR检测

对随机选取的14粒可能携带CGMMV的甜瓜进行检测，其中7粒种子中检测到CGMMV目的条带，带毒50%（图4-A）；分别检测可能携带CMV、SqMV和MNSV的种子10粒，均只有2粒检测出对应的病毒的目的条带（图4-B、C、D），带毒率20%。在可能携带CGMMV和SqMV的种子检测中分别有1份样本未检测出作为内参的18 S rRNA条带。对0.1 g（约20粒）种子大样本4种病毒RT-PCR检测。结果发现5份重复样本中CGMMV、CMV、SqMV和MNSV分别被检测出5、3、5和4份样本呈现阳性（图5）。

3 讨 论

甜瓜干种子含有大量多糖、蛋白质以及次生代谢物质，其中糖类物质含量高达25%[13]，因此在抽提RNA过程中就必须首先要除去多糖的污染。多糖的许多理化性质与RNA很相似，在沉淀RNA 时，会产生多糖的凝胶状沉淀与RNA共沉淀下来，造成RNA产量的减少；含有多糖的RNA沉淀难溶于水[14]。同时多糖可以抑制许多酶的活性，被多糖污染的RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究[6]。

Chomczynski等发明的酸酚/胍盐RNA提取法是目前实验室最常用的RNA提取方法，主要产品是TRIZOL。该方法的优点是采用单一试剂，并且操作简单耗时较短，对大多数的动植物样本都能得到质量很好的RNA样品[7]。但是在乙醇或异丙醇沉淀步骤不能区别RNA和其他多糖，所以不适合于大部分富含多糖和多酚的植物材料。Fang等[6]在提取松树等植物RNA时，提高Na+或K+浓度，用苯酚、氯仿抽提可以除去多糖。宋贵生等[15]在提取水稻未成熟种子RNA时，在用酸性酚抽提之前，加入1/10体积的5 mol·L-1 NaCl，混匀和离心后会看到白色沉淀，表明可以去除大部分多糖。同时在沉淀RNA时，加入等体积的高盐溶液和异丙醇溶液，多糖物质更容易留在上清，而异丙醇选择性将RNA沉淀下来[16]。本文中改良TRIZOL法就是在异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法的基础上，采用高浓度的NaCl来沉淀匀浆上清液中的多糖，同时在RNA沉淀时加入等体积的高盐溶液和异丙醇溶液，在1 h之内即可得到高质量的总RNA，且不含有DNA污染，能满足分子生物学检测的需要。

CTAB是一种阳离子去污剂，在高离子溶液存在的条件下，CTAB 与多糖和蛋白质形成复合物而沉淀下来，而核酸仍然留在溶液中[17]。如Lewinsohn等[18]在应用CTAB法从裸子植物木质茎中提取RNA时，在匀浆上清液中加入乙醇至终体积分数10%；Bahloul等[19]在提取云杉组织的RNA时在匀浆上清液中加入1/3体积的5 mol·L-1醋酸钾（pH 4.8）溶液以沉淀多糖。Su等[20]在去除褐藻的多糖时，应用乙醇和醋酸钾两者结合使用效果最佳。本试验CTAB裂解步骤采用低温下剧烈震荡进行细胞裂解操作，使所有的细胞散开，在抽提缓冲液中蛋白质、多糖形成复合物并产生沉淀，无水乙醇和醋酸钾同时沉淀多糖。再经过TRIzol或异硫氰酸胍提取步骤，可在90 min内完成整个抽提过程得到高质量RNA，虽有明显DNA污染，但不会对RNA病毒检测造成影响。比较本实验中改良TRIZOL法和后两种CTAB法中发现，前者操作和耗时更少，能获得相当质量和数量的总RNA，能应用于随后的病毒检测。

對同一病毒而言，种传率会随寄主种类、品系、栽培环境与遭受病毒感染的时期而改变，大多数的种传病毒其种传率通常不高，但种传率的高低并不与病毒对作物的影响程度成正比，与种子携带病毒的量成正比。所以检测种子是否带毒与带毒率高低是衡量种传病毒的潜在危险的方法[1]。本文在检测4种病毒的单粒种子时，发现其不同病毒的带毒率有一定的差异，CGMMV的带毒达到50%，而其他3种病毒只有20%（图4）。同时对20粒种子的大样本检测中发现有CMV的5份重复样本只有3份能检出病毒，则说明我们在一批次的种子检测时应该多次抽样检测，才能确认该批次种子是否带毒（图5）。

在本文中，引入植物看家基因18 S rRNA衡量干种子总RNA质量和RT-PCR反应质量，能很好对整个检测体系进行评估。在本试验的单粒种子检测中发现个别种子的18 S rRNA基因未扩增获得目的片段，原因可能是在总RNA提取过程中误操作导致RNA丢失。在病毒检测试验中引入18 S rRNA作为内参基因可避免假阴性的误判。

4 结 论

本研究在现有TRIZOL法和CTAB法提取植物总RNA方法的基础上进行改良，引入高盐溶液大大提高去除多糖和多酚能力，应用该方法提取甜瓜干种子总RNA，可以满足于种传病毒RT-PCR检测。同时建立了植物看家基因18 S rRNA为内参基因分别针对侵染葫芦科作物的CGMMV、CMV、SqMV和MNSV等4种主要种传病毒的两重RT-PCR检测方法。应用改良TRIZOL法和两重RT-PCR法分别对携带4种病毒的单粒和0.1 g（约20粒）的甜瓜种子进行检测，可检测到对应的病毒，并且18 S rRNA作为内参基因可以对整个检测体系进行评估，减少由于误操作造成的假阴性误判。

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