骨髓间充质干细胞条件培养基对INS-1细胞凋亡的影响

赵坤，郝好杰，臧丽，杨国庆，李祥，韩为东，母义明

·基础研究·

骨髓间充质干细胞条件培养基对INS-1细胞凋亡的影响

赵坤，郝好杰，臧丽，杨国庆，李祥，韩为东，母义明

目的 探讨骨髓间充质干细胞条件培养基(BMSC-CM)对促炎因子诱导大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)凋亡的影响及其作用机制。方法 培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)至第3代，收集、浓缩其上清液，获得富含BMSCs分泌因子的条件培养基。用含促炎因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ的培养基处理INS-1细胞48h，造成炎症损伤β细胞模型，加入不同浓度的BMSC-CM继续培养12h，所获细胞分为以下5组：正常对照组，促炎因子组，1×BMSC-CM组，2×BMSC-CM组，4×BMSC-CM组。采用CCK-8法检测INS-1细胞存活率，膜连蛋白V/碘化丙啶(Annexin V/PI)检测细胞凋亡率，二氯荧光素双醋酸盐(DCFH-DA)检测细胞内活性氧(ROS)的生成量。结果 与正常对照组相比，促炎因子组INS-1细胞存活率下降至正常对照组的75.84%±1.53%，细胞凋亡率增加(17.23%±1.77%)，细胞内ROS水平明显升高(34.3%±0.80%)，差异均具有统计学意义(P<0.01)。而BMSC-CM有效对抗了促炎因子导致的INS-1细胞损伤，其作用呈剂量依赖性，4×BMSC-CM组效果最佳，该组INS-1细胞存活率较促炎因子组升高了11.86%，达到87.7%±2.08%，细胞凋亡率下降至8.67%±1.59%，ROS生成量减少至17.1%±2.14%，差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论 BMSC-CM可抑制促炎因子诱导的INS-1细胞凋亡，其作用机制可能与BMSC-CM降低细胞内ROS水平有关。

间质干细胞；细胞凋亡；炎症；INS-1细胞

[Key words]mesenchymal stem cells; apoptosis; inflammation; INS-1 cells

骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是具有不断增殖、自我更新及多向分化等特点的成体干细胞[1-4]。目前越来越多的研究表明，BMSCs在多种免疫疾病中可起到免疫调节及抗炎作用，这种效应与其分泌的多种细胞因子密切相关[5-6]。近年来，大量研究证实2型糖尿病是一种慢性低度炎症性疾病[7]。研究发现，2型糖尿病患者伴有多种炎症因子升高，如C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、IL-6、IL-1β、TNF-α等[8]。这些炎症因子不仅直接参与胰岛素抵抗[9]，还能诱导β细胞凋亡[10]。因此，减少慢性炎症引起的β细胞凋亡，对延缓2型糖尿病的进展具有重要意义[11]。本研究利用促炎因子处理大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)，建立慢性炎症损伤β细胞的体外模型，探索BMSCs条件培养基(bone marrow-derived mesenchymal stem cell-conditioned medium，BMSC-CM)对促炎因子诱导INS-1细胞凋亡的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 INS-1细胞株由解放军总医院基础所分子生物室提供。大鼠BMSCs原代细胞提取自体重100～120g的健康雄性大鼠骨髓，培养至第3代时使用。

1.1.2 主要试剂与仪器 RPMI 1640培养基，胎牛血清，青霉素，链霉素，丙酮酸钠(美国Gibco公司)；DMEM(低糖)(美国Hyclone公司)；β-巯基乙醇(美国Sigma公司)；TNF-α、IL-1β、IFN-γ(美国Peprotech公司)；PEG 20000(德国Merck公司)；CCK-8试剂盒(日本Dojindo公司)；Annexin V-FITC/Propidium Iodide(PI)凋亡试剂盒(美国BD Biosciences公司)；活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测试剂盒(美国Molecular Probes公司)。酶标仪(美国Thermofisher公司)，流式细胞仪(美国BD Biosciences公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠BMSCs的培养及收集、浓缩条件培养基 大鼠BMSCs的分离、培养及鉴定见参考文献[12]。大鼠BMSCs传至第3代时改用无血清培养基培养，48h后收集上清液，在4℃下3000r/min离心10min，将上清液转移到可以截留分子量7kD的过滤袋中，4℃环境中使其在PEG 20000作用下浓缩至10×，再经220nm滤器过滤后无菌保存备用。根据实验设计，对INS-1细胞进行处理时，将浓缩为10×的BMSC-CM分别稀释为1×、2×、4×BMSCCM加入对应组的INS-1细胞中。

1.2.2 INS-1细胞的处理与分组 以含有TNF-α (30ng/ml)、IL-1β(5ng/ml)、IFN-γ(30ng/ml)的培养基处理INS-1细胞48h，然后加入不同浓度的BMSCCM继续培养12h，检测各项指标。实验分为5组：正常对照组、促炎因子组、1×BMSC-CM组、2×BMSC-CM组、4×BMSC-CM组，各组最终处理时间均为60h。

1.2.3 CCK-8法检测细胞存活率 INS-1细胞按5×103/孔密度接种于96孔板中，每组设5个复孔。各组干预完成后，吸弃原培养基，每孔加入含10μl CCK-8的新鲜培养基100μl，继续孵育2h，用酶标仪检测450nm波长下各孔的吸光度(A)值。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡 各组经相应处理的INS-1细胞用不含EDTA的胰酶消化，收集细胞并用预冷的PBS洗2次，再加入结合缓冲液充分重悬细胞，最后加入Annexin V-FITC和PI试剂室温避光反应10min，同时设定未处理空白对照、Annexin V-FITC单染、PI单染，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.5 ROS的检测 各组细胞处理后吸弃培养基，收集胰酶消化后的细胞，无血清培养基洗1次，加入用无血清培养液按1:1000稀释的DCFH-DA(终浓度为10μmol/L)，37℃细胞培养箱内孵育20min。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。用流式细胞仪检测，激发波长488nm，发射波长535nm。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0件进行分析，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 BMSCs形态学表现与表型鉴定 大鼠BMSCs培养至第3代时，细胞多呈长梭形、纺锤形，细胞融合达80%～90%时，呈同心圆样排列。将培养至第3代的BMSCs消化成单细胞悬液进行免疫荧光染色，流式细胞仪检测显示CD11a、CD45呈阴性表达，CD73、CD90、CD105呈阳性表达，符合BMSCs的典型特征(图1)。

2.2 BMSC-CM对INS-1细胞存活率的影响 采用CCK-8法检测INS-1细胞存活率，将对照组细胞存活率设为100%，结果显示，促炎因子组INS-1细胞存活率下降至对照组的75.84%±1.53%(P<0.01)；而加入3种浓度(1×、2×、4×)的BMSC-CM后，INS-1细胞的存活率分别升高至79.28%±1.67%(P>0.05)、85.7%±1.43%(P<0.01)、87.7%±2.08%(P<0.01)，其中2×BMSC-CM组及4×BMSC-CM组与促炎因子组相比差异有统计学意义(图2)。

图1 大鼠BMSCs的形态与表型鉴定Fig.1 Morphology and identification of BMSC phenotypes (scale bar, 500µm)

2.3 BMSC-CM对INS-1细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测结果显示，与正常对照组(3.90%±0.31%)相比，促炎因子组的INS-1细胞凋亡(早期凋亡+晚期凋亡)率(17.23%±1.77%)明显增高(P<0.01)。加入BMSC-CM后，随着浓度增加(1×、2×、4×)，INS-1细胞凋亡率呈明显下降趋势，分别降至16.34%±1.22%(P>0.05)、11.53%±0.54%(P<0.05)、8.67%±1.59%(P<0.01)，变化具有剂量依赖性，但其中1×BMSC-CM组与促炎因子组比较差异无统计学意义，提示BMSC-CM达到一定的有效浓度才能对促炎因子刺激的INS-1细胞起到抗凋亡作用(图3)。

图2 BMSC-CM对INS-1细胞存活率的影响Fig.2 Effect of BMSC-CM on cell survival rate of proinflammatory cytokines-treated INS-1 cells

图3 BMSC-CM对INS-1细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of BMSC-CM on the apoptosis of pro-inflammatory cytokines-induced INS-1 cells

2.4 BMSC-CM对INS-1细胞内ROS含量的影响 流式细胞仪检测结果显示，与正常对照组(11.8%±1.21%)相比，促炎因子组INS-1细胞内ROS含量(34.3%±0.80%)明显增加(P<0.01)；而加入3种浓度(1×、2×、4×)的BMSC-CM后，INS-1细胞内ROS含量呈明显下降趋势，分别降至30.9%±0.99%(P>0.05)、23.73%±1.10%(P<0.01)、17.1%±2.14%(P<0.01)，其中2×BMSC-CM组及4×BMSC-CM组与促炎因子组相比差异有统计学意义(P<0.01，图4)。

图4 BMSC-CM对细胞内ROS含量的影响Fig.4 Effect of BMSC-CM on intracellular ROS in pro-inflammatory cytokines-treated INS-1 cells

3 讨 论

慢性炎症是影响2型糖尿病发生和发展的重要因素[8]。长期的慢性炎症刺激可造成β细胞进行性损伤；TNF-α、IL-1β、IFN-γ等促炎因子可通过NF-κB、JNK等通路对β细胞产生细胞毒作用，引起β细胞凋亡[13]。本实验中也发现促炎因子组的INS-1细胞存活率明显下降，细胞凋亡增多。

在许多疾病中，BMSCs都表现出强大的免疫调节及抗炎能力[14]。Ortiz等[15]证实在博来霉素诱导的肺损伤模型中，BMSCs能有效减轻炎症反应并抑制肺组织纤维化。Han等[16]的研究显示，在大鼠脊髓损伤模型中，BMSCs可通过削弱TLR4信号通路及降低IL-1β、TNF-α水平来缓解脊髓炎症反应。Yeung等[17]也发现BMSCs与离体胰岛共培养后可明显抑制促炎因子引起的β细胞凋亡，维持葡萄糖刺激的β细胞胰岛素分泌功能。同时，大量研究结果指出BMSCs是通过分泌多种细胞因子发挥细胞保护、抗凋亡、抗炎作用的，如IGF-1、VEGF、HGF、bFGF等[6,18]。本研究应用富含BMSCs分泌因子的条件培养基干预炎症损伤的INS-1细胞，结果显示BMSC-CM能有效抑制促炎因子引起的INS-1细胞凋亡，而且随着BMSC-CM浓度的提高，细胞凋亡率呈明显下降趋势，具有剂量依赖性，进一步说明BMSCs可通过分泌效应起到抗炎效果。

值得注意的是，本研究发现BMSC-CM明显降低了促炎因子环境下INS-1细胞内的ROS水平。有研究表明，促炎因子的刺激可引起细胞内ROS生成增多[19]，而胰岛β细胞较其他细胞对ROS更为敏感，β细胞内累积的ROS可引起脂质过氧化、线粒体损伤、DNA链断裂等一系列细胞内的异常变化，最终导致细胞凋亡。减少细胞内ROS含量能有效抑制β细胞凋亡[20-21]。因此，我们认为BMSC-CM降低ROS水平很可能是其抑制促炎因子诱导的INS-1细胞凋亡的途径之一。

BMSCs具有来源广泛、伦理争议少等优势，临床应用前景广阔。我们之前已有研究[9]证实BMSCs在治疗2型糖尿病时能降低血糖，促进胰岛修复，改善胰岛素抵抗。本研究以INS-1细胞为研究对象，应用BMSC-CM进行培养进一步发现BMSCs可通过其分泌效应减少促炎因子诱导的INS-1细胞凋亡，为临床应用BMSCs治疗2型糖尿病的机制解析提供了新的理论依据。鉴于BMSCs分泌的物质较多，今后的研究将致力于分析起免疫调节及抗炎作用的具体的细胞因子，并探索能特异性增加这些因子分泌量的培养环境，使BMSCs更高效地应用到2型糖尿病的临床治疗中。

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增能理论和陆九渊心学各自有两个核心观念，增能理论的核心观念是“权能”和“增强权能”，“增强权能”也被翻译成“增能”，陆九渊心学的核心观念是“本心”和“发明本心”。通过比较我们可以发现这四个观念两两之间也存在相似性。

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Effect of bone marrow mesenchymal stem cells-conditioned medium on the apoptosis of INS-1 cells

ZHAO Kun1, HAO Hao-jie2, ZANG Li1, YANG Guo-qing1, LI Xiang2, HAN Wei-dong2, MU Yi-ming1*1Department of Endocrinology,2Laboratory of Molecular Biology, Institute of Basic Medicine, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China
*

, E-mail: muyiming@301hospital.com.cn
This work was supported by the 863 Projects of the Ministry of Science and Technology of China (2013AA020105)

ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of bone marrow mesenchymal stem cell-conditioned medium (BMSC-CM) on pro-inflammatory cytokines-induced apoptosis of insulinoma cells (INS-1).MethodsThe conditioned medium containing various cytokines and growth factors was collected and condensed from the supernatants of culture medium of BMSC of rats at passage three. After exposed to the medium with a pro-inflammatory cytokines cocktail containing TNF-α, IL-1β and IFN-γ for 48 hours, INS-1 cells were cultured with BMSC-CM in different concentrations for another 12 hours. INS-1 cells were divided into the following five groups: control group, pro-inflammatory cytokines-treated group, 1× BMSC-CM-treated group, 2× BMSC-CM-treated group and 4× BMSC-CM-treated group. The survival rate of INS-1 cells was assessed by CCK8 assay. The incidence of cell apoptosis was measured using Annexin V/PI staining. Intracellular reactive oxygen species (ROS) production was determined with dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA).ResultsCompared with the control group, prolonged exposure to pro-inflammatory cytokines induced significant decrease in the viability of INS-1 cells (75.84%±1.53%) and a great increase in the incidence of cell apoptosis (17.23%±1.77%), and also in intracellular ROS level (34.3%±0.80%) with statistically significant difference (P<0.01). However, BMSC-CM treatment protected INS-1 cells against pro-inflammatory cytokines-induced injury in a dose-dependent manner. Among the BMSC-CM of three different concentrations, 4× BMSC-CM exhibited best protective effects on pro-inflammatory cytokines-treated INS-1 cells, as reflected by increased cell viability (87.7%±2.08%) and significant reduction in the incidence of cell apoptosis (8.67%±1.59%), and also in intracellular ROS production (17.1%±2.14%) with statistically significant difference (P<0.05).ConclusionBMSC-CM protected INS-1 cells against pro-inflammatory cytokines-induced apoptosis, the possible mechanism underlying this effect might be associated with the reduction of intracellular ROS level.

R587.1

A

0577-7402(2015)05-0339-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.05.01

2015-02-12；

2015-04-02)

(责任编辑：张小利)

国家高技术研究发展计划(863计划)(2013AA020105)

赵坤，硕士研究生。主要从事糖尿病干细胞治疗的基础与临床研究

100853 北京 解放军总医院内分泌科(赵坤、臧丽、杨国庆、母义明)，基础医学所分子生物室(郝好杰、李祥、韩为东)

母义明，E-mail：muyiming@301hospital.com.cn