降钙素基因相关肽调节核转录因子-κB信号转导对缺氧c-kit+心脏干细胞凋亡的影响

龙仙萍，郑小宇，王冬梅，许官学，赵然尊，石蓓

降钙素基因相关肽调节核转录因子-κB信号转导对缺氧c-kit+心脏干细胞凋亡的影响

龙仙萍，郑小宇，王冬梅，许官学，赵然尊，石蓓

目的探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对缺氧环境下c-kit+心脏干细胞凋亡的影响。方法体外建立c-kit+心脏干细胞缺血缺氧模型，实验分为缺氧+CGRP组，缺氧+CGRP8-37(CGRP拮抗剂)组，细胞缺氧对照组，常氧细胞组，缺氧+BAY11-7082[核转录因子-κB(NF-κB)抑制剂]组。采用免疫荧光检测细胞缺氧后NF-κB转位情况；采用Western blotting检测NF-κB通道蛋白的表达，同样方法检测CGRP干预后NF-κB转位及通道蛋白表达。同时用流式细胞仪检测CGRP干预后细胞凋亡率。结果在缺氧状态下，NF-κB信号通路被激活，NF-κBP65发生核转位(呈现红色荧光)。与细胞缺氧对照组比较，缺氧+CGRP组NF-κB相关信号蛋白P-I-κB、NF-κBP65及NF-κBP50表达减少(P<0.05)；与缺氧+CGRP组比较，CGRP+CGRP8-37组上述NF-κB相关信号蛋白表达增加(P<0.05)。在细胞凋亡方面，与缺氧对照组比较，缺氧+CGRP组早、晚期细胞凋亡率均降低(P<0.05)；与缺氧+CGRP组比较，缺氧+CGRP8-37组细胞早期凋亡增加(P<0.05)。结论CGRP在调节NF-κB信号的同时抑制了缺氧环境下c-kit+心脏干细胞的凋亡。

降钙素基因相关肽；NF-κB；缺氧；c-kit+心脏干细胞；细胞凋亡

细胞疗法是目前治疗缺血性心肌病的重要手段之一[1]，以往研究主要集中在骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为细胞移植的种子细胞[2-3]。本课题组以往研究显示，BMSCs移植在一定程度上能改善心肌梗死后心脏功能，并可减少血管成形术后再狭窄的发生[4]。心脏干细胞(CSCs)具有组织特异性和专一性，可分化为心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞。目前多项研究已证实，与BMSCs相比，CSCs具有更强的心肌修复作用[5]。然而无论何种细胞作为细胞疗法的种子细胞，皆受困于心肌梗死后局部恶劣的微环境使移植细胞存活数量极少[6-8]。目前，人们正寻求各种方法来增加移植细胞的存活力。本课题组前期研究显示，降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)干预BMSCs后，在体外观察到CGRP抑制核转录因子-κB(NF-κB)转录，增强缺氧状态下BMSCs的存活，并且BMSCs的增殖分化不受影响[9]。针对是否CGRP对缺氧状态下CSCs也具有同样的保护作用，本实验建立体外细胞缺血缺氧模型，观察CGRP对缺氧状态下c-kit+CSCs凋亡的影响，并观察抑制NF-κB信号转导对上述CGRP 在c-kit+CSCs凋亡中的作用，以期能为心脏干细胞有效治疗心肌梗死提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 随机选择清洁级4～6周龄小鼠，雌雄不限，购自第三军医大学实验动物中心。大鼠/小鼠CGRP多肽(Phoenix Pha Rmaceuticals，美国)，大鼠/小鼠CGRP8-37多肽(Phoenix Pharmaceuti Cals，美国)，兔抗小鼠NF-κBP50抗体(博士德公司)，兔抗小鼠NF-κBP65抗体(Santa Cruz公司)，兔抗小鼠IκB-a(Phospho-Ser32/Ser36)，兔抗小鼠IκB-a抗体、NF-κB激活-核转运检测试剂盒、BAY11-7082(NF-κB抑制剂)(碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠c-kit+CSCs的获取 无菌下处死4～6周龄小鼠，分离小鼠双侧心耳，剪碎成大小为1mm3的组织块后置于15ml离心管中，加入0.1% Ⅱ型胶原酶，于37℃恒温水浴锅中边摇晃边消化约1h；1200r/min离心5min，弃上清。Ham's/F-12完全培养基重悬并分装于细胞培养瓶内，37℃、5%CO2孵箱中孵育。待细胞铺满瓶底至80%～90%时，弃培养基，加入0.05%胰蛋白酶消化分离贴壁细胞，1200r/min离心5min，弃上清。1%BSA封闭，含1%FBS的Ham's/F-12培养基5ml(不含双抗)重悬细胞，加入兔抗小鼠c-kit抗体(1:250)，垂直混合仪上4℃旋转孵育1h；1200r/min离心5min，弃上清，Ham's/F-12培养基3ml重悬细胞，加入羊抗兔二抗包被磁珠(1:150)，再次置于垂直混合仪上，4℃孵育0.5h。孵育完后置于DYNAL磁力架上，移液枪轻轻吸除管中液体(不可触碰管壁一侧附着的棕褐色磁珠)，培养基重悬细胞，于37℃、5%CO2孵箱中孵育，每隔2d全量换液一次。待c-kit+CSCs铺满瓶底至80%～90%时，流式细胞仪检测细胞表面抗原c-kit、CD34、CD45的表达。

1.2.2 体外CSCs缺血缺氧模型的建立 取c-kit+CSCs，并将培养基更换为无血清Ham's/F-12培养基后继续孵育24h，使细胞达到同步化状态。移至37℃三气孵箱中进行缺氧处理，孵箱内3种气体比例分别为N2 94%、CO25%、O21%，缺氧12h进行后继实验。

1.2.3 免疫荧光检测NF-κB信号通路核转位情况 实验分为5个组，分别是缺氧+CGRP组、缺氧+CGRP8-37(CGRP拮抗剂)组、缺氧+BAY11-7082(NF-κB抑制剂)组、细胞缺氧对照组、常氧细胞组。参考前期课题组方法[4]，收集不同干预组细胞标本后，固定洗涤细胞，然后加入封闭液，室温封闭1h。吸除封闭液后加NF-κBP65抗体，4℃孵育过夜。洗涤后加抗兔Cy3，室温孵育1h，洗涤后加细胞核染色液(DAPI)，室温染色5min左右。吸除核染色液，洗涤后滴加抗荧光淬灭封片液，封片后荧光显微镜下观察。

1.2.4 Western blotting检测NF-κB及相关信号蛋白表达 实验分为5个组，分别是缺氧+CGRP组、缺氧+CGRP8-37(CGRP拮抗剂)组、缺氧+BAY11-7082(NF-κB抑制剂)组、细胞缺氧对照组、常氧细胞组。参考前期课题组方法[4]，分别收集各组蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜及封闭后，分别加入兔抗小鼠IκB-a抗体(1:200)、兔抗小鼠IκB-a(Phospho-Ser32/Ser36)抗体(1:500)、兔抗小鼠NF-κBP50抗体(1:200)、兔抗小鼠NF-κBP65抗体(1:200)、兔抗小鼠β-actin抗体(1:400)、兔抗小鼠GAPDH抗体(1:200)4℃孵育过夜，加入HRP标记山羊抗兔IgG二抗，室温孵育1h后显影。采用Biorad GelDoc XR成像系统对目的蛋白进行定性及定量分析。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 实验分为4个组，分别是缺氧+CGRP组、缺氧+CGRP8-37(CGRP拮抗剂)组、细胞缺氧对照组、常氧细胞组。收集各干预组细胞，加入Ham's/F-12完全培养基重悬细胞，取1×105个重悬细胞，1200r/min离心5min，弃上清，加入195μl Annexin V-FITC结合液+5μl Annexin V-FITC混匀并重悬细胞。室温(20～25℃)避光孵育10min，1200r/min离心5min，弃上清，加入190μl Annexin V-FITC结合液+10μ碘化丙啶(PI)染色液混匀并重悬细胞，冰浴避光放置。另设3管对照，分别为空白细胞管、仅加5μl Annexin V-FITC管及仅加10μl PI管。上机前向各管中再加入300μl Annexin V-FITC结合液，枪头轻轻吹打混匀，进行流式细胞仪检测。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 c-kit+CSCs的分离、培养及鉴定 原代CSCs贴壁生长12d后，倒置显微镜下可见细胞形态一致，呈长梭状或多角形，分布不均匀(图1A)。待原代细胞基本铺满细胞瓶底时，行免疫磁珠分选法分选出c-kit+CSCs继续培养，细胞生长约6d时，高倍显微镜下可见细胞体积与未分选前相比稍有增大，周围附有数个半透明折光度强的圆形小磁珠(图1B)。行FACS鉴定示c-kit+CSCs表面抗原的表达为c-kit阳性，而CD34、CD45为阴性。

2.2 Western blotting检测c-kit+CSCs上CGRP受体表达情况 CGRP受体由受体活性修饰蛋白-1(receptor activity modifying protein-1，RAMP1)、降钙素受体样受体(calcitonin receptor-like receptor，CRLR)和受体组成蛋白(receptor component protein，RCP)组成。CGRP通过与细胞表面CGRP受体即RAMP1/CRLR复合物结合发挥作用。Western blotting结果显示，c-kit+CSCs上有RAMP1、CRLR及RCP受体的表达(图2)。

图1 大鼠c-kit+CSCs细胞培养(×200)Fig.1 Cultivation of rat c-kit+CSCs (×200) A. Primary generation of CSCs cultivated for 12d; B. c-kit+CSCs after magnetic beads separation

图2 Western blotting检测c-kit+CSCs上CGRP受体的表达Fig.2 Expression of CGRP receptor in c-kit+CSCs (Western blotting)RAMP1. Receptor activity modifying protein-1; RCP. Receptor component protein; CRLR. Calcitonin receptor-like receptor

图3 免疫荧光检测CGRP对NF-κB信号通路核转位的影响(×200)Fig.3 Effect of CGRP on the nuclear translocation of NF-κB signal pathway (Immunofluorescence ×200)

2.3 CGRP调节缺氧c-kit+CSCs中NF-κB信号通路

2.3.1 CGRP对NF-κB信号通路核转位的影响 未被激活的NF-κB和IκB-α形成一个复合物，分布在细胞质内，当其被外界因素激活，IκB-α发生磷酸化后与NF-κB解离，NF-κB的亚基p65及p50进入至细胞核内。应用免疫荧光法检测细胞缺氧后NF-κB转录，转录后NF-κBP65呈红色荧光，细胞核呈蓝色荧光。免疫荧光法检测结果显示，常氧细胞组和缺氧+BAY11-7082组的细胞核内几乎无红色荧光，而细胞缺氧对照组与缺氧+CGRP8-37组见大量红色荧光表达，缺氧+CGRP组细胞内红色荧光较少(图3)，表明缺氧下诱导NF-κB信号转录，CGRP对NF-κB信号通路有调控作用。

2.3.2 CGRP调节NF-κB信号通路蛋白的表达Western blotting检测结果(图4)显示，细胞缺氧后12h，与常氧细胞组比较，细胞缺氧对照组P-I-κB、NF-κBP65及NF-κBP50表达增加(P<0.05)，进一步证实缺氧诱导NF-κB转录。与细胞缺氧对照组及缺氧+CGRP8-37组比较，缺氧+CGRP组P-I-κB、NF-κBP65及NF-κBP50表达降低(P<0.05)，与细胞缺氧对照组比较，缺氧+CGRP8-37组上述NF-κB通道蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，然而，与缺氧+BAY11-7082组比较，缺氧+CGRP组中P-I-κB、NF-κBP65及NF-κBP50蛋白表达明显增加(P<0.05)。

图4 Western blotting法检测CGRP对NF-κB信号通道蛋白的影响Fig.4 Effect of CGRP on NF-κB signal channel protein (Western blotting)(1)P<0.05 compared with normal oxygen group; (2)P<0.05 compared with hypoxia control group; (3)P<0.05 compared with hypoxia+CGRP group; (4)P<0.05 compared with hypoxia+CGRP8-37group

图5 流式细胞仪检测CGRP调节NF-κB信号通路后c-kit+CSCs存活的影响Fig.5 Influence of CGRP regulating NF-κB signal channel on c-kit+CSCs survival (Flow cytometry)Q1. Dead cells; Q2. Late apoptotic cells; Q3. Survived cell ; Q4. Early apoptotic cells. (1)P<0.05 compared with normal oxygen group; (2)P<0.05 compared with hypoxia control group; (3)P<0.05 compared with hypoxia+CGRP group

2.4 CGRP对c-kit+CSCs细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测细胞凋亡结果(图5)显示，与常氧细胞组比较，细胞缺氧对照组心脏干细胞早、晚期凋亡率均明显增高(P<0.05)，与细胞缺氧对照组比较，缺氧+CGRP组CSCs细胞早、晚期凋亡率明显降低(P<0.05)，且细胞存活率升高；然而CSCs缺氧并加入CGRP受体拮抗剂(CGRP8-37)后，与缺氧+ CGRP组比较，缺氧+CGRP8-37组早期细胞凋亡增加(P<0.05)，晚期细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

在心脏干细胞移植治疗心肌梗死的过程中，最棘手的难题则是如何提高移植细胞的存活率及分化率，以减轻心肌梗死后微环境对移植细胞的损伤，并且最大限度的发挥细胞效应。Hong等[8]发现经冠脉内输注CSCs至心肌梗死小鼠心脏后的5min，不足40%的CSCs存在于心脏中，而接下来的24h内，心脏中大于85%的移植CSCs丢失，细胞移植后第7天，仅有3.56%±2.03%的细胞存活，而在移植后的35d，细胞存活率下降至2.46%±0.46%。以上结果表明心肌梗死后局部缺氧、炎症等微环境的改变对移植细胞的存活起了关键性作用。

NF-κB是炎症信号激活通路，各种促炎因子和细菌产物均可激活NF-κB信号通路，导致促炎基因的转录调控，从而促进炎症进程[10]。静息状态下NF-κB亚基p65通常与I-κB结合，覆盖p50蛋白的核定位信号，以无活性的三聚体形式存在于细胞质中。当细胞受到炎症、应激及氧化剂等刺激时，I-κB磷酸化并水解，与NF-κB解离，活化的NF-κBp65和p50亚基转位至细胞核内，启动炎性因子及凋亡基因的转录[11]。其中，p65亚基主要发挥促炎、促纤维化及凋亡作用的。Gordon等[12]证实NF-κB的激活也可引起炎性因子(TNF-α、IL-6 及ICAM-1)表达增加、促凋亡基因(Fas-L、Fas、C-mys)表达上升和抑凋亡基因(Bcl-2、Bcl-XL)表达下降。Yang等[13]发现抑制NF-κB/I-κBα/IKK信号通路后，细胞黏附分子和组织因子的表达均减少，炎症反应亦减轻。由此本实验设想，如果抑制了NF-κB信号通路，可否明显改善移植细胞不利的炎症微环境，从而增加移植细胞的存活率。Guan等[14]亦发现CGRP连接至RAMP1/CLR受体二聚体上可增加细胞cAMP水平，激活PKA，活化的PKA通过干扰I-κBα磷酸化降解来抑制NF-κB的活性，进而促进DNA连接抑制剂p50/p50二聚体形成。因此，CGRP 对NF-κB炎症通路应该是发挥抑制作用的。为了验证CGRP能否通过直接抑制NF-κB炎症通路发挥抑制细胞凋亡的作用。

本实验用细胞免疫荧光法观察NF-κBp65亚基的核转位情况，结果显示细胞缺氧后12h，激活NF-κB转录入核，当抑制缺氧细胞中的CGRP受体后，缺氧+CGRP8-37组见大量红色荧光表达，NF-κBP65转录表达增加，缺氧+CGRP组细胞核红色荧光少，NF-κBP65表达减少。用Western blotting法检测各组中NF-κB通道蛋白P-I-κB、I-κB、NF-κBP65及NF-κBP50的表达水平，得到类似结果，即，缺氧组中，P-I-κB、NF-κBP65及NF-κBP50的表达明显增加(P<0.05)，提示缺氧状态下，c-kit+CSCs中的NF-κB信号通路被激活。使用CGRP处理细胞后，上述蛋白的表达明显下降，但与NF-κB抑制剂(BAY11-7082)作用的缺氧细胞比较，CGRP处理细胞后其NF-κB相关信号蛋白表达仍增加，为了进一步证实CGRP 对NF-κB信号通路的作用，在缺氧细胞中加入CGRP受体拮抗剂后，观察到NF-κB相关信号蛋白的表达接近于细胞缺氧对照组，以上结果表明，虽然CGRP对NF-κB通道的抑制作用较NF-κB抑制剂低，但CGRP能明显抑制NF-κB信号转录。

结合以上实验结果，可以初步认为，在c-kit+CSCs中，CGRP能够抑制P-I-κB、NF-κBP65和NF-κBP50的表达，干扰NF-κB亚基发生核转位，对炎症通路NF-κB信号通路有着明确的抑制作用。那么，CGRP是否通过抑制NF-κB信号通路增加c-kit+CSCs的抗凋亡能力呢？流式细胞仪结果显示，与常氧CSCs比较，细胞缺氧对照组细胞早、晚期凋亡率均增高。在缺氧细胞中加入CGRP干预后，与细胞缺氧对照组比较，其细胞早期和晚期凋亡率均降低，但拮抗CGRP作用后，细胞凋亡率明显增高。本实验初步观察到了CGRP对细胞凋亡的作用，结合上述研究结果，CGRP能明显抑制NF-κB信号转录，由此推断CGRP可能通过调节NF-κB信号通路来调节c-kit+CSCs细胞凋亡。本课题组下一步将研究干扰NF-κB信号通道后CGRP对c-kit+CSCs细胞凋亡的影响，以期为CGRP通过调节NF-κB信号通路抑制细胞凋亡提供更有力的证据。

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Effect of calcitonin gene related peptide regulated nuclear factor kappa B signal transduction on c-kit+cardiac stem cells in hypoxia state

LONG Xian-ping, ZHENG Xiao-yu, WANG Dong-mei, XU Guan-xue, ZHAO Ran-zun, SHI Bei*
Department of Cardiology, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi, Guizhou 563003, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author, E-mail: shibei2147@163.com

, E-mail: shibei2147@163.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (NSFC81360021), and the International Cooperative Project of Guizhou Province [Qiankehewai G (2013)7037]

ObjectiveTo investigate the effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on the apoptosis of c-kit+cardiac stem cells in hypoxia.MethodsIschemia and hypoxia models of c-kit+cardiac stem cells were reproducedin vitro. The models were divided into hypoxia+CGRP group, hypoxia+CGRP8-37(antagonist of CGRP) group, hypoxia control group, normal oxygen group, and hypoxia+BAY11-7082[antagonist of nuclear factor kappa B (NF-κB)] group. NF-κB translocation after hypoxia was detected by immunofluorescence, and NF-κB channel proteins were determined with Western blotting. The NF-κB translocation and the expression of NF-κB channel proteins after CGRP intervention were detected, and the cell apoptosis rate after intervention was determined with flow cytometry in each group.ResultsUnder hypoxia the NF-κB signal pathway was activated, and nuclear translocation occurred in NF-κBP65(red fluorescence). Compared with hypoxia control group, the expressions of NF-κB related proteins such as P-I-κB, NF-κBP65and NF-κBP50decreased obviously (P<0.05). Compared with the hypoxia+CGRP group, the expressions of NF-κB related proteins increased significantly (P<0.05) as mentioned above in hypoxia+CGRP8-37group. Both the early and late apoptotic rates declined in hypoxia+CGRP group compared with that of hypoxia control group (P<0.05), however, the early apoptotic rate increased markedly in hypoxia+CGRP8-37group as compared with that of hypoxia+CGRP group (P<0.05).ConclusionUnder hypoxia, CGRP may regulate the NF-κB signal pathway, and at the same time suppress the apoptosis of c-kit+cardiac stem cells.

calcitonin gene-related peptide; nuclear factor kappa B; anoxia; c-kit+cardiac stem cells; apoptosis

R363

A

0577-7402(2015)10-0782-06

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.10.03

2015-05-22；

2015-08-05)

(责任编辑：张小利)

国家自然科学基金(81360021)；贵州省国际合作项目[黔科合外G字(2013)7037号]

龙仙萍，医学硕士，副主任医师。主要从事心肌梗死后心肌细胞再生修复的基础及临床研究

563003 贵州遵义 遵义医学院附属医院心内科(龙仙萍、郑小宇、王冬梅、许官学、赵然尊、石蓓)

石蓓，E-mail：shibei2147@163.com