正交法优化乌蔹莓多糖提取工艺研究

江 念，陈根洪，郑小江，2∗，陈耀兵

（1.湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北恩施445000；2.生物资源保护与利用湖北省重点实验室（湖北民族学院），湖北 恩施 445000；3.湖北民族学院园艺林学学院，湖北 恩施 445000）

正交法优化乌蔹莓多糖提取工艺研究

江 念1，陈根洪1，郑小江1，2∗，陈耀兵3

（1.湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北恩施445000；2.生物资源保护与利用湖北省重点实验室（湖北民族学院），湖北 恩施 445000；3.湖北民族学院园艺林学学院，湖北 恩施 445000）

为深度开发利用乌蔹莓，以乌蔹莓复叶为材料，采用水浸提法考察提取温度、提取时间、料液比三个因素对多糖得率的影响.用硫酸苯酚法测定多糖的含量并以SPSS统计软件对正交试验结果进行处理和分析.结果表明：提取时间和料液比的影响达到极显著水平，提取温度的影响达到显著水平.乌蔹莓多糖得率最高提取工艺为：提取时间1h、提取温度90℃、料液比1∶80，多糖得率为5.16%.

乌蔹莓；多糖提取；正交优化

乌蔹莓（Cayratia japonica（Thunb）Gagne.为葡萄科乌蔹莓属（Cayratia）植物．别名母猪藤、五爪龙、五叶藤、地五加等［1－2］.具有清热解毒、解毒消肿、活血散淤、利尿止血的作用［3－4］.且易采集和炮制，全草皆可入药，对痢疾杆菌、溶血性葡萄球菌、大肠杆菌有很好的抑制作用［5－6］.乌蔹莓属植物在亚洲、欧洲、和非洲约有30余种，在我国约有16种，主产秦岭以南各省区［1］.乌蔹莓在恩施州分布广泛、易于栽种，发展前景良好.

随着现代研究的深入，多糖的药用价值和保健功能逐渐被认可.研究证明，多糖具有抗病毒、抗癌、降血糖血脂、抗氧化抗衰老、增强机体免疫能力等多种保健功能，多糖的市场需求也在不断扩大［7－10］.近年来，对乌蔹莓药理及化学成分方面的研究较多，但对乌蔹莓活性成分提取工艺的研究还鲜有报道，本试验通过优化乌蔹莓多糖提取工艺，为深度开发利用恩施州乌蔹莓野生资源提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

材料：乌蔹莓采自于湖北省农业科学院中药材研究所中药材实验基地（恩施市新塘乡长岭岗）.主要试剂：芦丁、葡萄糖、石油醚、苯酚、浓硫酸、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠.

1.2 仪器与设备

TU－1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；DFY—500高速粉碎机（由天津泰斯特仪器有限公司生产）；GXZ－9140数显鼓风干燥箱（海博讯实业有限公司医疗设备厂）；SZ－93双重蒸馏水器（上海亚荣生化仪器厂）；数显恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司）；FA－1004B电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；TDL－80－2B离心机（上海安亭科学仪器厂）.

1.3 试验方法

1.3.1 材料处理 取乌蔹莓复叶，置于烘箱中60℃烘干，用粉碎机粉碎成粉末，过60目筛，保存备用.

1.3.2 乌蔹莓多糖提取以及其含量测定 提取方法：水提醇沉法［11－12］，测定方法：硫酸苯酚法［13］.

1.3.3 葡萄糖标准曲线的绘制 以葡萄糖作为标准品来制作标准曲线.准确称取105℃干燥至恒重的葡萄糖样品200.00mg，加蒸馏水溶解，定容至200mL，制成1.00mg·mL－1溶液，取出100 mL上述溶液液于1000 mL容量瓶中，制成0.1mg·mL－1的葡萄糖标准溶液.分别精确量取上述溶液10、20、30、40、50、60 mL，置于6个100mL容量瓶中，加蒸馏水摇匀定容.分别取1mL，置于6个25mL的具塞试管中，加入新制成的5%的苯酚溶液1.0mL，再快速加入5mL浓硫酸，另以1mL蒸馏水为对照.在25℃温度下放置30min，波长490nm处测定其吸光度值，以吸光度为纵坐标，葡萄糖质量浓度为横坐标，绘制标准曲线.得回归方程为：y＝10．417x－0．0055，R2＝0．9997．

式中：C为葡萄糖质量分数mg／（mL）－1；V为最终稀释体积／mL；N为稀释倍数；m为样品质量／mg.

1.3.4 单因素试验

1）称取0.4g乌蔹莓粉末放入具塞试管中，固定提取时间2h、提取温度70℃，设定料液比1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100，探究料液比对乌蔹莓多糖得率的影响.

2）称取0.4g乌蔹苺粉末放入具塞试管中，固定提取时间2 h、料液比1：80，设定温度60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，探究提取温度对乌蔹莓多糖得率的影响.

3）称取0.4g乌蔹苺粉末放入具塞试管中，固定料液比1∶80，提取温度80℃，设定时间0.5、1、1.5、2、2.5 h，研究提取时间对乌蔹莓多糖得率的影响.

1.3.5 正交实验 由单因素结果，确定正交试验因素水平表，见表1.

表1 正交试验因素水平表Tab.1 The factors and lever of orthogonal experiment

2 结果与分析

2.1 料液比对乌蔹莓多糖得率的影响

料液比对乌蔹莓多糖得率的影响，见图1.由图1可得，随着料液比的增加，乌蔹莓多糖得率逐渐增加，但是在1∶60、1∶80、1∶100处已趋平缓，考虑资源问题1∶60为比较理想的料液比.

2.2 提取温度对乌蔹莓多糖得率的影响

提取温度对乌蔹莓多糖得率的影响，见图2.由图2可得，随着温度的增加，乌蔹莓多糖得率呈现先增加后下降的趋势，并在80℃处有最大值，80℃后多糖得率下降可能是由于高温导致多糖内部结构破坏，故选择最适提取温度为80℃.

图1 料液比对乌蔹莓多糖得率影响Fig.1 Effect of solid／liquid ratioon the yields of polysaccharides in Cayratia japonica

2.3 提取时间对乌蔹莓多糖得率的影响

提取时间对乌蔹莓多糖得率的影响，见图3.由图3可得，随着时间的推移，乌蔹莓多糖得率呈现先增加后下降的趋势，并在1h处有最大值，1h后多糖得率下降可能是持续高温破坏了多糖的内部结构，故选择最适提取时间为1h.

图2 提取温度对乌蔹莓多糖得率影响 Fig.2 Effect of extraction temperatureon the yields of polysaccharide in Cayratia japonica

图3 提取时间对乌蔹莓多糖得率的影响Fig.3 Effect of extraction timeon the yields of polysaccharides in Cayratia japonica

2.4 乌蔹莓多糖得率正交试验

以提取温度、提取时间、料液比设计三因素三水平正交试验，试验为3个重复，取两个接近值制得表2.

表2 乌蔹莓多糖得率正交试验结果Tab.2 The result of orthogonal experimentof polysaccharide in Cayratia japonica

正交试验结果采用SPSS统计分析软件处理，将所得的数据进行方差分析，结果见表3和表4.

表3 乌蔹苺正交试验结果方差分析Tab.3 The analysis of variance of orthogonal experiment in Cayratia japonica

表4 提取时间、提取温度、料液比对乌蔹莓多糖得率影响的Duncan多重比较结果Tab.4 Duncan Multiple comparison results of extraction temperature，extraction time and ratio of material to liquor influenced on the yield of polysaccharides Cayratia japonica

由表3可知，FA＝879.016、FB＝4.096、FC＝29.034，A、C两个因素的P值小于0.01，达到极显著水平，因素B的P值小于0.05，达到显著水平，这表明料液比和提取时间对试验结果有极显著的影响，提取温度对试验结果有显著影响.由表4得，乌蔹莓多糖最佳提取工艺为A2B2C3，即提取时间1 h、提取温度90℃、料液比1∶80.

2.5 验证试验

为验证正交试验结果，准确称取乌蔹莓粉末0.4g，以正交方差分析所得最佳优化组合A2B2C3处理样品后，所得乌蔹莓多糖得率为5.16%，和正交试验中的结果接近且高于其他组合，表明该优化组合能有效的提高乌蔹莓多糖得率.

3 结论

本研究通过单因素和正交试验，探求提取时间、提取温度和料液比对乌蔹莓多糖得率的影响，结果表明其最佳提取工艺为：提取时间1h、提取温度90℃、料液比1∶80，多糖得率为5.16%.本试验为乌蔹莓的开发利用提供相应的理论指导.

［1］《中国中草药汇编》编写组.全国中草药药汇编［M］.北京：人民卫生出版社，1983：214－215.

［2］中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴［M］.北京：科学出版社出版，第2册，1976：782－783.

［3］黄国文.正交法优选乌蔹莓过氧化物酶活性的测定条件［J］.安徽农业科学，2013，41（22）：9228，9244.

［4］昝丽霞.乌蔹莓花色苷的提取工艺及稳定性研究［J］.食品工业科技，2013，34（10）：251－253.

［5］肖文.乌蔹莓根茎的显微鉴定研究［J］.时珍国医国药，2001，12（7）：609.

［6］李京民，王静苹，袁立明.乌蔹莓化学成分的研究［J］.中医药学报，1995（2）：52－53.

［7］罗祖友，吴季勤，吴谋成.植物多糖的抗氧化与抗病毒活性［J］.湖北民族学院学报：自然科学版，2007，25（1）：77－81.

［8］石玉涛，余志，陈玉琼.2种茶叶多糖降血糖效果的比较［J］.华中农业大学学报：自然科学版，2015，34（2）：113－119.

［9］邹瑶.茉莉花渣多糖降血糖、改善糖尿病症状作用的研究［J］.食品科技，2011（2）：157－160.

［10］苟兴能，张克英，勾宗蓉，等.川麦冬多糖对四氧嘧啶糖尿病小鼠的降血糖作用的实验研究［J］.食品工业科技，2012，33（13）：359－360.

［11］包鸿慧，于婷婷，盛佳，等.超声波辅助热水浸提黑木耳多糖工艺的优化研究［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2013，25（3）：45－49.

［12］刘菊，王君明，纪彬，等.猫爪草粗多糖提取工艺研究［J］.中医学报，2012，175（27）：1622－1623.

［13］YamamotoY，Murosaki S，Yamauchi R，et al.Structural study on an exocellular polysaccharide produced by Lactobacillus helveticus TY1－2［J］. Carbohydrate Research，1994，261：67－78.

责任编辑：高 山

Orthogonal Optimization of Extraction Procedure of Polysaccharide in Cayratia japonica

JIANG Nian1，CHEN Genhong1，ZHENG Xiaojiang1，2∗，CHEN Yaobing3
（1.School of Biological Science and Technology，Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China；2.Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization of Hubei Province（Hubei University for Nationalities），Enshi 445000，China；3.School of Gardening Forestry，Hubei Uniersity for Nationalities，Enshi 445000，China）

In order to develop and utilize Cayratia japonica deeply，we adopt water extraction to investig⁃aret the effect of extraction temperature，extraction time and ratio of material to liquor on the yield of poly⁃saccharides using Cayratia japonica′s compound leaves as materials.The phenol－sulfuric acid method is used to measure the content of polysaccharides，and the SPSS statistical software is used to process and analyze the orthogonal experiment results.The results indicated that the effects of extraction time and ratio of material to liquor reached an extremely significant level，while the effects of extraction temperature reached a significant level.The extraction process which was the highest yield of Cayratia japonica poly⁃saccharides was extraction time 1 h，extraction temperature 90℃ and ratio of material to liquor 1∶80 when the yield of polysaccharides was 5.16%.

Cayratia japonica；extraction of polysaccharide；orthogonal optimization

TS201.4

A

1008－8423（2015）03－0334－03

10.13501／j.cnki.42－1569／n.2015.09.027

2015－07－26.

湖北省自然科学基金创新群体项目（2009CD115）；湖北省教育厅高校产学研究项目（CYX2009B037）.

江念（1991－），男，硕士生，主要从事林特食品资源保护与利用的研究；∗

郑小江（1958－），男，教授，主要从事野生植物资源保护与利用的研究.