1株高效降解偶氮染料菌株的筛选与鉴定

冯玮+石海英+徐伟+柳仁民

摘要：从山东聊城某印染厂污水处理池的活性污泥中筛选出1株能高效降解偶氮染料苋菜红的菌株ts1-2，从生理生化特性和16S rDNA序列2个方面对该菌株进行鉴定，初步鉴定为驹形白色杆菌（Leucobacter komagata）。在静置培养条件下对该菌株的脱色反应进行研究，结果表明，ts1-2菌株在染料初始浓度50 mg/L时有最佳脱色率，染料最大脱色浓度为1 250 mg /L。在最适脱色条件下脱色14 h，染料脱色率可达到95%以上。

关键词：偶氮染料;苋菜红;16s rDNA;脱色率

中图分类号： X703;Q939.9 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）04-0352-03

收稿日期：2014-04-21

基金项目：国家自然科学基金（编号：31170110）。

作者简介：冯 玮（1984—），女，山东聊城人，硕士研究生，讲师，主要从事资源微生物研究。E-mail：fengwei01@lcu.edu.cn。

通信作者：柳仁民，博士，教授，主要从事分析化学研究。E-mail：liurenmin@lcu.edu.cn。

偶氮染料是一类在生产中广泛使用的染料，它具有色调范围广、色牢度高、合成成本低等优点，可用于纺织、皮制品的染色及印花等。在纺织工业中使用的偶氮染料约占染料总量的70%[1]。

染料废水是较难处理的工业废水。废水中的染料不仅是原料的损失，也会污染环境，阻碍水体自身的净化，对水生植物和鱼类有毒害作用。水中的染料吸收了太阳光，削弱了光在水中的透射，从而抑制了水体中水生植物的光合作用，影响其生长，进而影响到整个食物链，使水生生态系统的多样性下降[2]，所以颜色的去除是处理染料废水所面临的一个重要问题。此外，从染料的结构、性质和特点可以判断，大多数染料都具有潜在的毒性[3-4]。这就要求染料废水在排放入环境前必须处理。

本试验以偶氮染料苋菜红为降解对象，筛选能够高效降解此染料的菌种。细菌脱色偶氮染料的机理是产生能降解偶氮染料的偶氮还原酶，本研究还探讨了该菌株的产酶方式，为下一步优化产酶条件研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 采样 菌种采自山东聊城某印染厂污水处理车间厌氧污泥。

1.1.2 培养基 富集培养基：牛肉膏1 g，酵母膏1 g，蛋白胨5 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 000 mL;pH值7.0±0.2。脱色培养基：胰蛋白胨10 g，酵母浸出物5 g，氯化钠5 g，蒸馏水 1 000 mL。

1.1.3 偶氮染料 苋菜红（amaranth），化学式见图1。无特殊说明情况下，苋菜红染料均为50 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 脱色菌株筛选 将印染厂污水处理车间采集的污泥制成悬浊液，取上清液加入到活化富集培养基中富集，再转移到以偶氮染料为唯一碳源的培养基中驯化，驯化采用一次性投加高浓度化合物的驯化方法，每个驯化周期结束时，取一定体积培养基加入到新鲜的唯一碳源培养基中，并不断提高培养基中偶氮染料的含量，经过多次驯化后，反复进行平板涂布，分离出对偶氮染料有高效降解能力的菌株。

1.2.2 菌种鉴定 （1）形态学观察：将脱色菌株在细菌生长固体培养基平板上培养24 h，经革兰氏染色后，用显微镜观察细胞形态。 （2）生理生化特征：参照《伯杰氏细菌鉴定手册》及参考文献[5]进行鉴定。 （3）16S rRNA基因序列分析：采用 UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌株DNA。应用16S rRNA两端保守区域设计引物——正向引物7F （5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′）和反向引物1540R （5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）进行PCR扩增。扩增反应体系模板 （基因组 DNA 20～50 ng/μL） 0.5 μL，5× buffer 2.5 μL，dNTPs （各 2.5 mmol/L） 1 μL，7F primer 0.5 μL，1540R primer 0.5 μL，补加 ddH2O 至 25 μL。扩增反应条件为 97 ℃ 3 min;97 ℃ 25 s，55 ℃ 25 s，72 ℃ 1 min，30 个循环;72 ℃ 10 min。PCR 产物用 1%琼脂糖电泳检测。PCR 得到的扩增产物送交给生工生物工程（上海）股份有限公司测序，得到的 16S rRNA 核苷酸序列登陆 NCBI，输入GenBank 数据库进行BLAST比对，获取与其核酸序列相似度高的菌种。采用MEGA 5.0软件进行多序列匹配比对，计算相似序列之间的进化距离，利用 Neighbor-Joining 构建系统发育树。

1.2.3 产酶模式研究 测定细菌生产曲线，同时测定菌株对染料的脱色率和最大脱色浓度。将菌种接入到未加染料的LB培养基中，37 ℃静置培养过夜，将培养液按体积分数2%的量加入到染料培养基中进行脱色试验。培养液在 8 000 r/min 条件下离心10 min，取上清液在染料的最大吸收峰520 nm处测其吸光度，按照公式计算脱色率：

脱色率=D0-DtD0×100%。

式中：D0为加入细菌前染料的吸光度，Dt为加入细菌t时间后染料的吸光度。

2 结果与分析

2.1 菌种鉴定

2.1.1 形态学观察 经过分离筛选，并比较24 h内的脱色效率，得到1株能高效降解苋菜红偶氮染料的菌株ts1-2。当染料浓度为50 mg/L时，菌株ts1-2能在14 h内降解95%染料，最大脱色浓度为1 250 mg/L（图2）。经观察菌株在平板培养基上菌落为圆形，边缘整齐，白色或乳白色，镜检为革兰氏阳性，杆状，不运动。endprint

2.1.2 生理生化特征。菌株ts1-2部分生理生化特征见表1。

表1 菌株ts1-2部分生理生化特征

生理生化试验 生理生化

特征 生理生化试验 生理生化

特征

淀粉水解 - V. P. 反应 -

七叶苷水解 - 利用有机酸

脲酶 + 乙酸 +

硫化氢产生 + 草酸 +

吲哚产生 - 柠檬酸 -

硝酸盐还原 - 乳酸 +

甲基红试验 + 琥珀酸 +

〖3〗 马脲酸 +

2.1.3 16S rRNA基因序列分析 将扩增得到的16S rRNA 基因电泳检测，测得其序列长度为1 405 bp。经 BLASTn 软件序列分析，结果表明ts1-2与驹形白色杆菌（Leucobacter komagatae）聚为一簇，同源性最高。从GenBank中调取与细菌ts1-2同源性较高的15株菌株的16S rRNA 基因序列构建系统发育树见图3。结果显示，ts1-2与L.komagatae种相似度最高达99%。根据菌株的形态学特征、生理生化特征和16S rRNA 基因序列分析，初步确认ts1-2菌为驹形白色杆菌。

2.2 产酶模式研究

将菌株在37 ℃条件下静置培养测定其生长曲线，发现细菌ts1-2在4～14 h内为对数生长期，14～60 h内为平衡期，60 h后进入衰亡期（图4）。

细菌能够使偶氮染料褪色，是因为菌体产生了能够降解偶氮染料的偶氮还原酶[6]。Hu等证明，细菌分泌的偶氮还原酶为一种诱导酶而不是固有酶[7]。在培养基中加入染料作为诱导物，菌体则会产生偶氮还原酶。测定细菌ts1-2生长24 h内脱色率，结果如图5所示。

菌体进入对数生长期时，菌体的脱色效率成指数增长，表明菌体内的偶氮还原酶随菌体增多而增多。当菌体生长进入平衡期后，菌体数量不再增加，重复加入染料后发现菌体仍有脱色能力，但脱色速率变小，说明能够还原染料的酶虽然保持一定活性但是没有新的酶产生，这种酶的合成方式应为同步合成型。

3 结论

纺织废水由于所含染料具有色度高、化学结构稳定以及

难于被降解等特点，成为目前最难处理和最受关注的废水之一。偶氮染料在纺织染料中所占的比例最高，超过了70%。目前处理染料废水的物理和化学方法具有处理成本高、处理不彻底并且容易造成二次污染等缺点[8]。因此，筛选高效降解偶氮染料的微生物，将其应用于染料废水处理具有深远的意义，并且逐渐成为研究的热点之一。

本试验从印染厂染料废水处理反应池的活性污泥中，筛选分离出1株能使偶氮染料苋菜红脱色的菌株ts1-2。从形态学特征、生理生化特征和16S rDNA基因序列比对3个方面对菌株进行鉴定，确定其为驹形白色杆菌（L. komagatae）。

Suzuki 等从纺织厂污水处理装置附近土壤中得到1株能够还原偶氮染料的芽孢杆菌OY1-2[9]。Wong 等从染料废水污泥中分离出能够在好氧条件下将甲基红脱色的细菌肺炎克雷伯氏菌RS-13[10]。Hu等发现的菌株Pseudomonas luteola在完全静止或完全振荡的条件下均不降解染料，但在 2 d振荡加 2 d静止的条件下对染料的脱色效果显著[11]。本次分离得到的菌株ts1-2仅在静置培养14 h就能使 50 mg/L 浓度染料脱色95%以上，培养条件简单，脱色效率高。本试验还发现此菌株的产酶方式为同步合成型，为进一步优化菌株产酶条件的工作奠定了基础。

参考文献：

[1]Saratale R G，Saratale G D，Kalyani D C，et al. Enhanced decolorization and biodegradation of textile azo dye Scarlet R by using developed microbial consortium-GR[J]. Bioresource Technology，2009，100（9）：2493-2500.

[2]薛方亮，张雁秋. 染料废水处理技术最新研究进展[J]. 水科学与工程技术，2007（2）：26-29.

[3]Aouadene A，Di Giorgio C，Sarrazin L，et al. Evaluation of the genotoxicity of river sediments from industrialized and unaffected areas using a battery of short-term bioassays[J]. Environmental and Molecular Mutagenesis，2008，49（4）：283-299.

[4]Umbuzeirog A，Freeman H，Warren S H，et al. The contribution of azodyes to themutagenic activity of the Cristais River[J]. Chemosphere，2005，60：55-64.

[5]刘洪灿，周培瑾，横田明，等. 白色杆菌属一新种的分离鉴定及其系统发育学分析[J]. 微生物学报，1999，39（5）：396-401.

[6]柳广飞，周集体，王 竞，等. 细菌对偶氮染料的降解及偶氮还原酶的研究进展[J]. 环境科学与技术，2006，29（4）：112-114.

[7]Hu T L. Degradation of azo dye RP2B by Pseudomonas luteola[J]. Water Science and Technology，1998，38（4/5）：299-306.

[8]杨清香，贾振杰，杨 敏.微生物染料脱色研究进展[J]. 微生物学通报，2006，33（4）：144-148.

[9]Suzuki Y，Yoda T，Ruhul A，et al. Molecular cloning and characterization of the gene coding for azoreductase from Bacillus sp. OY1-2 isolated from soil[J]. Journal of Biological Chemistry，2001，276（12）：9059-9065.

[10]Wong P K，Yuen P Y. Decolorization and biodegradation of methyl red by Klebsiella pneumoniae RS-13[J]. Water Research，1996，30（7）：1736-1744.

[11]Hu T L. Decolourization of reactive azo dyes by transformation with Pseudomonas luteola[J]. Biosource Technology，1994，49：47-51.endprint